教育裝備采購網(wǎng)：藥用甘草為豆科植物烏拉爾甘草GlycyrrhizauralensisFisch.，脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根莖，是多年生藥用草本植物。植化研究表明甘草中存在大量的酚類成分，這些具有生物活性的成分有望成為開發(fā)新藥的來源[1]。甘草查爾酮A(licochalconeA)是存在于甘草中的一種酚類查爾酮化合物[2]，臨床及藥理研究表明，甘草查爾酮A具有抗氧化[3]、抗炎[4]、抗菌[5]、抗腫瘤[6]、抗利什曼原蟲病[7]、免疫促進(jìn)和雌激素樣[8]等活性，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景，但有關(guān)其含量測(cè)定的方法還未見報(bào)道。本文建立了甘草查爾酮A的HPLC含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步開發(fā)甘草中這一重要活性成分提供簡便可行的檢測(cè)方法。
1儀器與試劑
美國Agilent1100液相色譜儀系統(tǒng);KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
甘草由新疆昆侖神農(nóng)有限公司贈(zèng)送，經(jīng)新疆甘草種植中心鑒定分別為烏拉爾甘草GlycyrrhizauralensisFisch.，脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.和光果甘草GlycyrrhizaglabraL.。甘草查爾酮A對(duì)照品，本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)質(zhì)譜、碳譜和氫譜鑒定為甘草查爾酮A(licochalconeA),歸一化測(cè)定含量為98.81%。乙腈、甲醇為色譜純;水為重蒸水;其他試劑均為分析純。
2方法與結(jié)果
2.1溶液制備
2.1.1對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取在60℃干燥至恒重的甘草查爾酮A對(duì)照品適量，用流動(dòng)相配成濃度為0.1mg·ml-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，待用。
2.1.2供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取干燥恒重甘草粉末(過60目篩)0.5g，置100ml具篩錐形瓶中，加入甲醇25ml，超聲處理(功率200W，頻率40kHz)30min，過濾，再加入甲醇20ml，超聲處理30min，合并濾液，減壓濃縮至干，加流動(dòng)相溶解并定容至50ml，微孔濾膜(0.45μm)過濾，即得供試品溶液。
2.2色譜條件
色譜柱為大連依利特HypersilODS2C18柱(4.6mm×250mm,5μm);柱溫25℃;流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1);檢測(cè)波長372nm;流速1.0ml·min-1。
2.3方法學(xué)考察
2.3.1線性關(guān)系考察
準(zhǔn)確吸取甘草查爾酮A對(duì)照品儲(chǔ)備液2，4，6，8，10ml分別置于5個(gè)10ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度。分別吸取上述對(duì)照品溶液各10μl，依次注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以濃度C(μg/ml)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=41308C-142057，r=0.9992，線性范圍為：0.2～1.0μg。
2.3.2精密度實(shí)驗(yàn)
準(zhǔn)確吸取濃度為100μg·ml-1的甘草查爾酮A標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.51%，說明儀器良好。
2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
準(zhǔn)確稱取同一批次的脹果甘草5份，按“2.1.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，依次測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算甘草查爾酮A的含量，計(jì)算甘草查爾酮A含量的RSD為2.54%，表明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性較好。
2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
取同一份待測(cè)供試品溶液，在0,2,4,8,12h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得甘草查爾酮A峰面積值并計(jì)算樣品峰面積的RSD為1.72%，表明供試品溶液于12h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)
準(zhǔn)確稱取已知含量的樣品約0.1g(共5份)，精密加入0.10mg/ml的甘草查爾酮A標(biāo)準(zhǔn)品1ml，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備所需溶液，測(cè)定并計(jì)算含量。表1結(jié)果表明甘草查爾酮A平均回收率為98.76%，RSD為1.94%。表1樣品加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(略)
2.4樣品測(cè)定
按照本方法的測(cè)定條件，分別測(cè)定《中國藥典》收錄的3種甘草樣品，計(jì)算甘草查爾酮A的含量，結(jié)果見表2。甘草查爾酮A標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC圖譜見圖1～2。表2甘草查爾酮A含量測(cè)定結(jié)果(略)
3討論
3.1色譜條件選擇
比較了乙腈-水(60∶40)、甲醇-水(70∶30)、甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)、乙腈-甲醇-水(40∶30∶30)等流動(dòng)相體系，結(jié)果第3種流動(dòng)相分離效果最好，所以，本文選用甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)為流動(dòng)相。
3.2溶液制備方法
比較了不同提取溶劑(甲醇，乙醇，丙酮)和提取方法(回流提取，索氏提取，超聲提取)的提取效果，結(jié)果表明甲醇對(duì)甘草查爾酮A的提取效果優(yōu)于其他兩種溶劑，索氏提取和超聲提取的效果相當(dāng)，均優(yōu)于回流提取，但索氏提取耗時(shí)較長，故本文以甲醇為提取劑采用超聲提取制備樣品供試溶液。
3.3檢測(cè)波長的選擇在200～700nm之間對(duì)甘草查爾酮A對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明在372nm處有極大吸收，故選擇372nm為檢測(cè)波長。
結(jié)果表明該方法簡單，快捷，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，具有良好的重復(fù)性，可用于甘草中甘草查爾酮A的含量測(cè)定。
相關(guān)產(chǎn)品介紹：
系列Agilent 1100泵系統(tǒng)
● 電子流控閥(EFC)控制的毛細(xì)液相泵系統(tǒng)，精度高、流速范圍廣 柱流速范圍：1-20ul/min;10-100ul/min(可選件)
0.001-2.5m1/min(EFC關(guān)閉狀態(tài))
● 高壓制備泵系統(tǒng)，單元或雙元高壓制備泵
流速范圍:0.001-100m1/min
● 分析型泵系統(tǒng)
流速范圍：
單元泵：0.001-10m1/min
二元泵：0.001-5m1/min
四元泵：0.001-10m1/min
品種齊全的Agilent 1100系列進(jìn)樣系統(tǒng)
● 標(biāo)準(zhǔn)手動(dòng)進(jìn)樣器(分析型或制備型)
● 標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器
樣品瓶容量：可達(dá)100個(gè)(2mlx100)
進(jìn)樣量：0.1-100ul(0.1-1800ul)可選件
● 微盤式自動(dòng)進(jìn)樣器
樣品瓶容量：2x96(孔板)，2x386(孔板)或100x2ml
進(jìn)樣量：0.1-100ul(標(biāo)準(zhǔn)件)
0.1-1500ul可選件
● 微量標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器/微盤式自動(dòng)進(jìn)樣器
進(jìn)樣量：0.01-8ul(標(biāo)準(zhǔn));0.01-40ul(可選)
● 恒溫標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器/微盤式自動(dòng)進(jìn)樣器
溫度范圍：4-40℃可設(shè)定步進(jìn)1℃
● 220型微孔板式自動(dòng)進(jìn)樣器-組合化學(xué)樣品管理系統(tǒng)
樣品瓶容量：各種規(guī)格試管 多達(dá)12個(gè)微孔板(96孔板,384孔板)
進(jìn)樣量：0.1-5ul;0.1-20ul
Agilent 1100系列檢測(cè)器
● 可變波長掃描紫外檢測(cè)器(VWD)
波長范圍：190?600nm
● 多波長檢測(cè)器(MWD)
波長范圍：190?950nm(雙燈源)
● 二極管陣列檢測(cè)器(DAD)
波長范圍：190?950nm(雙燈源)
● 熒光檢測(cè)器(FID)
激發(fā)波長：200-700nm;
發(fā)射波長:280-900nm
光譜存儲(chǔ)：全光譜
● 示差折光檢測(cè)器(RID)
溫控：室溫+5℃至55℃
內(nèi)置自動(dòng)吹掃閥和自動(dòng)溶劑循環(huán)閥
● 電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)
● LC/MS四極桿質(zhì)量檢測(cè)器(MSD)
● LC/MS離子阱質(zhì)量檢測(cè)器(Trap MSD)
● 柱溫箱
溫度范圍：室溫下10℃至80℃
可選件：柱切換閥
● 真空在線脫氣機(jī)
