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問題
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可能原因
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解決方法
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無產(chǎn)物或產(chǎn)量低
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模板濃度偏低或偏高
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電泳檢測模板濃度，調(diào)整模板用量
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模板降解
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重新制備；基因組DNA、cDNA應(yīng)小量分裝后低溫保存
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模板中含有抑制反應(yīng)的雜質(zhì)
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純化模板
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引物濃度不足
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調(diào)整引物濃度，特別是針對長片段PCR
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引物存在二級結(jié)構(gòu)
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重新設(shè)計引物，避免二級結(jié)構(gòu)；優(yōu)化退火溫度
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引物降解
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引物應(yīng)高濃度小量分裝，-20℃保存，避免反復(fù)凍融
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Mg2+濃度偏低
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適當(dāng)提高M(jìn)g2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索最佳Mg2+濃度
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dNTP降解
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-20℃保存，小量分裝，避免反復(fù)凍融
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酶純度低，擴(kuò)增效率差
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選用高質(zhì)量DNA聚合酶
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酶量不足
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適當(dāng)增加酶量
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用酶不當(dāng)
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針對模板、目標(biāo)片段的特選擇適當(dāng)?shù)拿?詳見PCR產(chǎn)品選擇指南)
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緩沖液失效
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更換緩沖液或使用預(yù)混PCR反應(yīng)體系
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模板變性不充分
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適當(dāng)延長變性時間；對高GC或復(fù)雜結(jié)構(gòu)模板，提高起始變性溫度至98℃
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退火溫度偏高
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降低退火溫度，應(yīng)比引物Tm低至少5℃
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延伸時間不足
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增加延伸時間，特別是針對長片段PCR
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循環(huán)數(shù)目不夠
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增加循環(huán)數(shù)
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PCR管污染
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質(zhì)量可靠的PCR管通常不需滅菌，否則應(yīng)先高溫高壓滅菌處理；用過的PCR管不可清洗后重復(fù)使用
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PCR儀故障
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檢查程序和模塊溫度
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其他
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使用PCR增強(qiáng)劑
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非特異產(chǎn)物過多
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體系污染
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設(shè)計對照實驗尋找污染源，操作時應(yīng)注意避免交叉污染
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引物濃度過高
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適當(dāng)減少引物濃度
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引物序列特異性差
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重新設(shè)計引物
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Mg2+濃度過高
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降低Mg2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索最佳Mg2+濃度
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dNTP濃度過高
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降低dNTP濃度
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酶量過多
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減少酶量，以0.5 U間隔遞減
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退火溫度過低
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提高退火溫度
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延伸時間過短
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增加延伸時間，以1 min間隔遞增
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循環(huán)次數(shù)過多
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減少循環(huán)次數(shù)
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模板結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜或目標(biāo)片段過長
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特選擇適當(dāng)?shù)拿?詳見PCR產(chǎn)品選擇指南)；使用PCR增強(qiáng)劑
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其他
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HotStart PCR
TouchDown PCR
巢式PCR
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引物二聚體
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引物3’末端存在互補(bǔ)序列
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重新設(shè)計引物
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引物濃度過高
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降低引物濃度
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模板濃度過低
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提高模板濃度
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退火溫度不合適
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優(yōu)化退火溫度
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循環(huán)次數(shù)過多
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減少循環(huán)次數(shù)
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其他
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HotStart PCR
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拖尾嚴(yán)重
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引物濃度過高
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調(diào)整引物濃度
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引物序列特異性差或模板上存在同源序列
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重新設(shè)計引物
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模板降解
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重新制備模板
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模板濃度過高
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降低模板濃度
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dNTP濃度過高
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減少dNTP用量
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Mg2+濃度過高
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降低Mg2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索最佳Mg2+濃度
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酶量過多或質(zhì)量差
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減少酶量，以0.5 U間隔遞減；更換質(zhì)量可靠的酶
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變性溫度過低
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提高變性溫度，以0.5℃遞增
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退火溫度過低
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提高退火溫度
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延伸時間過長
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縮短延伸時間
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循環(huán)次數(shù)過多
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減少循環(huán)次數(shù)，以2個循環(huán)間隔遞減
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體系污染
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設(shè)計對照實驗，消除污染源
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其他
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HotStart PCR
TouchDown PCR
巢式PCR
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假陽性
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目標(biāo)片段與非特異擴(kuò)增片段間存在同源性
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設(shè)計陰性對照，確認(rèn)為引物問題后重新設(shè)計引物
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體系污染
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設(shè)計陰性對照判斷是否有污染，去除污染源
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