Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進行操作。
1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當?shù)牧呀庖海鏦estern及IP細胞裂解液、RIPA裂解液等，裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒進行抽提。
2. 電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以使用凝膠配制試劑盒進行配制，試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。
(2) 樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。
100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳
冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預染蛋白質分子量標準。
3. 轉膜(Transfer)
Western實驗中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。
轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
4. 封閉(Blocking)
轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
參考一抗的說明書，按照適當比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。 用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當?shù)姆跤郎囟群蜁r間。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
參考二抗的說明書，按照適當比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。 二抗需根據(jù)一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H L)。 用微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。
7. 蛋白檢測(Detection of proteins)
參考相關說明書，使用BeyoECL Plus等ECL類試劑來檢測蛋白。壓片可以采用專用的壓片暗盒進行。
8. 膜的重復利用(Membrane recovery)
如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復利用蛋白膜。
