一、操作方法

　　1、培養(yǎng)液中按1%的體積加雙抗(含青霉素1萬U/ml，鏈霉素0.01g/ml)及肝素液(含肝素100U/ml)。用3.5%NaHCO3液調(diào)pH值為7.2~7.4，然后加滅活的小牛血清，使?jié)舛葹?0%。再加PHA(50U~75U/ml)，無菌分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶1ml。上海創(chuàng)賽科技提供57-92-1，鏈霉素(標(biāo)準(zhǔn)品)Streptomycin，商品編號：C84-9623-200mg，價格77元。

　　2、無菌操作采血，并以肝素抗凝，同時進行白細胞計數(shù)及分類計數(shù)。

　　3、取0.1ml抗凝血，加入到含1ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，每個血樣接2~3個培養(yǎng)瓶。如果以血漿或分離的淋巴細胞代替全血，加入培養(yǎng)瓶中更好。上海創(chuàng)賽科技提供人抗凝血酶3Elisa試劑盒，Human Antithrombin III，AT III ELISA Kit，商品編號：LH-E10215HU-96T，價格1700元。

　　4、37℃培養(yǎng)72h，在培養(yǎng)結(jié)束前16h～24h，每瓶加入3H-TdR 1uci。

　　5、培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物移到離心管內(nèi)，用3%冰醋酸6ml，分兩次沖洗培養(yǎng)瓶，并將沖洗液也裝入離心瓶中，2 000r/min離心10min，去上清。沉淀再用3%冰醋酸洗滌一次，同樣離心去上清。

　　6、在沉淀中加30%H2O2液一滴，85℃水浴15min，待溶液呈無色時，再加甲酸0.5ml，繼續(xù)加熱(85℃)30min，使沉淀物完全消化溶解。

　　7、將消化溶解的液體移入測樣杯內(nèi)，用紅外燈或80℃熱空氣烘烤至液體體積少于0.1ml，加閃爍液5ml，用液體閃爍液計數(shù)器測其脈沖數(shù)。上海創(chuàng)賽科技提供132-98-9，青霉素V鉀，Penicillin V potassium salt，分析標(biāo)準(zhǔn)品，商品編號：C16-P11203-100mg，價格395元。

　　8、第5~7步驟制備閃爍液樣品也可以采用濾膜法制備。即：培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液移入離心管，2000r/min離心10min，棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌一次、再離心。將沉淀移至濾膜上(注意將沉淀全部移入)，減壓抽濾，并依次以10ml生理鹽水、5ml 5%三氯醋酸(若有帶色物質(zhì)，用30%H2O2液脫色)和3ml無水乙醇抽濾。取出濾膜，60℃~80℃烘干，然后將濾膜放入裝有5ml的閃爍液中(貼細胞的面朝上)，用液體閃爍液計數(shù)器檢測。

　　二、結(jié)果判定

　　以液體閃爍計數(shù)器測定每分的脈沖數(shù)cpm。取各管測定讀數(shù)的平均值，即為0.1ml血樣的脈沖數(shù)。全血檢測的脈沖數(shù)，再按血樣淋巴細胞計數(shù)結(jié)果，校正成每百萬淋巴細胞的脈沖數(shù)(cpm/106淋巴細胞)。也可以刺激指數(shù)(SI)表示試驗結(jié)果。為此須在培養(yǎng)時，設(shè)同樣數(shù)量的不加PHA的對照培養(yǎng)瓶，試驗管脈沖數(shù)與對照管脈沖數(shù)之比，即為刺激指數(shù)。

　　三、注意事項

　　1、血樣與培養(yǎng)基比例一般在1：10~1：30為宜。

　　2、培養(yǎng)細胞時，可放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，也可在普通溫箱進行培養(yǎng)，但一定要把蓋子擰緊，否則結(jié)果差別較大。

　　3、以SI表示結(jié)果時，一定要設(shè)置相同數(shù)量培養(yǎng)管的對照(即不加PHA)。而以cpm絕對值表示(cpm/106淋巴細胞)則可以不用設(shè)對照管。因為對照的cpm與本底比較接近，不同樣品之間的少許差別也不易確定其意義。

　　4、閃爍液的容水量很低，所以在加入閃爍液之前必須烘干。但加入一定量的醇類(如無水乙醇)，則可容納少量的處理后所殘留的水分，但也仍需烘至接近干燥的程度，否則將發(fā)生渾濁而無法測定。據(jù)報道，如果閃爍液中加入1/3的異辛基苯氧聚乙氧乙醇(TritonX-100)，其容水量可達15%，消化溶解后的樣品，不必烘干，即可添加閃爍液測定。

　　上海創(chuàng)賽科技性能卓越，白介素細胞因子，胎牛血清，電泳設(shè)備科學(xué)儀器，原料藥標(biāo)準(zhǔn)品，化學(xué)試劑，細胞培養(yǎng)耗材，上海創(chuàng)賽，海量產(chǎn)品特價促銷中，歡迎來電咨詢!