(一)核酸的鑒定

　　1.濃度鑒定 核酸濃度的定量鑒定可通過紫外分光光度法與熒光光度法進(jìn)行。

　　(1)紫外分光光度法：

　　紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的堿基均具有一定的紫外線吸收特性，最大吸收波長在250nm～270nm之間。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波長不變。由核苷酸組成核酸后，其最大吸收波長為260nm，該物理特性為測定溶液中核酸的濃度奠定了基礎(chǔ)。在波長260nm的紫外線下，1個(gè)OD值的光密度大約相當(dāng)于50μg/ml的雙鏈DNA，38μg/ml的單鏈DNA或單鏈RNA，33μg/ml的單鏈寡聚核苷酸。如果要精確定量已知序列的單鏈寡核苷酸分子的濃度，就必須結(jié)合其實(shí)際分子量與摩爾吸光系數(shù)，根據(jù)朗伯-比爾定律進(jìn)行計(jì)算。若DNA樣品中含有鹽，則會(huì)使A260的讀數(shù)偏高，尚需測定A310以扣除背景，并以A260與A310的差值作為定量計(jì)算的依據(jù)。紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液。上海創(chuàng)賽科技提供163795-75-3，SYBR Green 1，熒光染料，SYBR Green I nucleic acid gel stain;BR，商品編號(hào)：D23-RS1151-100微升，價(jià)格416元。

　　(2)熒光光度法：

　　熒光光度法以核酸的熒光染料溴化乙錠(ethidium bromide，EB)嵌入堿基平面后，使本身無熒光的核酸在紫外線激發(fā)下發(fā)出橙紅色的熒光，且熒光強(qiáng)度積分與核酸含量呈正比。該法靈敏度可達(dá)1ng～5ng，適合低濃度核酸溶液的定量分析。另外，SYBR Gold作為一種新的超靈敏熒光染料，可以從瓊脂糖凝膠中檢出低于20pg的雙鏈DNA。上海創(chuàng)賽科技提供溴化乙錠(EB),Ethidium bromide(EB),0.98,1239-45-8，商品編號(hào)：C84-4222-1G，價(jià)格300元。

　　2.純度鑒定 紫外分光光度法還是熒光光度法，均可用于核酸的純度鑒定。

　　(1)紫外分光光度法：

　　紫外分光光度法主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA的A260/A280比值為2.0。比值升高與降低均表示不純。其中蛋白質(zhì)與在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280nm與酚在270nm的高吸收峰可以鑒別主要是蛋白質(zhì)的污染還是酚的污染。RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值為1.8的DNA溶液不一定為純的DNA溶液，可能兼有蛋白質(zhì)、酚與RNA的污染，需結(jié)合其它方法加以鑒定。A260/A280的比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的一個(gè)良好指標(biāo)，2.0是高質(zhì)量RNA的標(biāo)志。但要注意，由于受RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)不同的影響，其讀數(shù)可能會(huì)有一些波動(dòng)，一般在1.8～2.1之間都是可以接受的。另外，鑒定RNA純度所用溶液的pH值會(huì)影響A260/A280的讀數(shù)。如RNA在水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris緩沖液(pH 7.5)中的讀數(shù)低0.2～0.3。

　　(2)熒光光度法：

　　用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可用于判定核酸的純度。由于DNA分子較RNA大許多，電泳遷移率低;而RNA中以rRNA最多，占到80%～85%，tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%～20%，mRNA占1%～5%。故總RNA電泳后可呈現(xiàn)特征性的三條帶。在原核生物為明顯可見的23S、16S的rRNA條帶及由5S的rRNA與tRNA組成的相對(duì)有些擴(kuò)散的快遷移條帶。在真核生物為28S、18S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA構(gòu)成的條帶(圖6-1)。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不見的。通過分析以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結(jié)果，我們可以鑒定DNA制品中有無RNA的干擾，亦可鑒定在RNA制品中有無DNA的污染。

　　3.完整性鑒定 常規(guī)使用凝膠電泳法。

　　(1)凝膠電泳法：

　　以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結(jié)果可用于判定核酸的完整性?；蚪MDNA的分子量很大，在電場中泳動(dòng)很慢，如果有降解的小分子DNA片段，在電泳圖上可以顯著地表現(xiàn)出來。而完整的無降解或降解很少的總RNA電泳圖，除具特征性的三條帶外，三條帶的熒光強(qiáng)度積分應(yīng)為一特定的比值。沉降系數(shù)大的核酸條帶，分子量大，電泳遷移率低，熒光強(qiáng)度積分高;反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強(qiáng)度積分低。一般28S(或23S)RNA的熒光強(qiáng)度約為18S(或16S)RNA的2倍，否則提示有RNA的降解。如果在加樣槽附近有著色條帶，則說明有DNA的污染。

　　(2)其它方法：

　　必要時(shí)，還可以通過一些特殊的試驗(yàn)來分析RNA的完整性，如小規(guī)模的第一鏈cDNA合成反應(yīng)、以放射性標(biāo)記的寡脫氧胸苷酸oligo(dT)為探針的Northern雜交以及對(duì)已知大小的mRNA的Northern雜交。另外，隨著毛細(xì)管電泳與生物芯片技術(shù)的飛速發(fā)展，有關(guān)核酸的分離、純化、鑒定與回收的手段日益豐富。

　　(二)核酸的保存

　　核酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，無需每次制備新鮮的核酸樣品，且一次性制備的核酸樣品往往可以滿足多次實(shí)驗(yàn)研究的需要，因此有必要探討核酸的貯存環(huán)境與條件。與分離純化一樣，DNA與RNA的保存條件也因性質(zhì)不同而相異。

　　1.DNA的保存

　　對(duì)于DNA來講，溶于TE緩沖液在-70℃可以儲(chǔ)存數(shù)年。其中TE的pH值為8，可以減少DNA 的脫氨反應(yīng)而pH低于7.0時(shí)DNA容易變性;EDTA作為二價(jià)金屬離子的螯合劑，通過螯合Mg2+、Ca2+等二價(jià)金屬離子以抑制DNA酶的活性;低溫條件則有利于減少DNA分子的各種反應(yīng);雙鏈DNA因結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)而具有很大的惰性，常規(guī)4℃亦可保存較長時(shí)間;在DNA樣品中加入少量氯仿，可以有效避免細(xì)菌與核酸的污染。上海創(chuàng)賽科技提供焦碳酸二乙酯，DEPC (Diethylpyrocarbonate),1609-47-8，商品編號(hào)：B11000132-100ml，價(jià)格680元。

　　2.RNA的保存

　　RNA可溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液或雙蒸消毒水中，-70℃至-80℃保存。若以焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白(RNasin)或氧釩核糖核苷復(fù)合物(vanadyl-ribonucleoside complex，VRC)，則可通過抑制RNA酶對(duì)RNA的降解而延長保存時(shí)間。另外，RNA沉淀溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可于-20℃長期保存。其中，甲酰胺溶液能避免RNase對(duì)RNA的降解，而且RNA極易溶于甲酰胺溶液，其濃度可高達(dá)4mg/ml。需要注意的是，這些所謂RNA酶抑制劑或有機(jī)溶劑的加入，只是一種暫時(shí)保存的需要，如果它們對(duì)后繼的實(shí)驗(yàn)研究與應(yīng)用有影響，則必須予以去除。上海創(chuàng)賽科技提供RNA酶抑制劑，RNasin Inhibitor，商品編號(hào)：B11000504-10000u，價(jià)格826元。

　　由于反復(fù)凍融產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)DNA與RNA核酸樣品均有破壞作用，在實(shí)際操作中，核酸的小量分裝是十分必要的。

　　(三)核酸的應(yīng)用

　　分離純化的核酸樣品，既可用于核酸本身功能與性質(zhì)的研究，亦可利用其功能與性質(zhì)進(jìn)行廣泛的應(yīng)用，如基因工程與蛋白質(zhì)工程均以核酸分子作為原始材料?？梢哉f，目前包括聚合酶鏈反應(yīng)，核酸的分子雜交與DNA重組與表達(dá)技術(shù)在內(nèi)的絕大多數(shù)分子生物學(xué)技術(shù)，都是以核酸分子為處理對(duì)象，利用核酸分子的堿基配對(duì)原理與核酸的一種或多種酶修飾性進(jìn)行的。絕大多數(shù)分子生物學(xué)技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是對(duì)DNA和RNA的分析。沒有核酸的分離與純化，分子生物學(xué)技術(shù)就沒有研究與應(yīng)用的基礎(chǔ)。

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