鹽析(Salting out)
鹽析方法是蛋白質(zhì)和酶提純工作中應(yīng)用最早，至今仍廣泛應(yīng)用的方法。其原理是蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中，隨著鹽濃度的逐漸增加，蛋白質(zhì)表面的電荷被中和，水化膜被破壞，蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中沉淀析出。鹽析法就是根據(jù)各種蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達到彼此分離的方法。
在鹽析時，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強度的關(guān)系可用下式表示：
式中S0是蛋白質(zhì)在純水(離子強度I=0)中的溶解度，S 為蛋白質(zhì)在離子強度為I的溶液中的溶解度，KS為鹽析常數(shù)。
上述公式中當溫度和pH 一定時，S0僅取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)。因此對于同一蛋白質(zhì)，在一定溫度和pH時，S0是一常數(shù)。
設(shè) Log S0 =β
則 Log S=β-KS×I
鹽析常數(shù)KS主要取決于鹽的性質(zhì)(鹽的離子價數(shù)和離子平均半徑),也和蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。不同的蛋白質(zhì)在同一種鹽溶液中的KS值不同，KS值愈大，鹽析效果愈好。從上述公式可知在溫度和pH一定的同一種鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)有各自一定的β和KS值。可以通過改變鹽的離子強度來分離不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱分段鹽析法。對于同一種鹽溶液，如果保持離子強度不變，通過改變溫度和pH 來改變β值，也可達到鹽析分離的目的。這種方法稱為“β分段鹽析法”。
鹽析法提純蛋白質(zhì)時應(yīng)注意以下幾個條件的選擇。
(一)鹽的種類
蛋白質(zhì)鹽析常用中性鹽。主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。應(yīng)用最廣泛的是硫酸銨，其優(yōu)點是：
1.溶解度大 25℃時硫酸銨的溶解度可達4.1mol/L(541g/L)以上。大約每升水可溶解767g之多。在這一高溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以被鹽析沉淀出來。上海創(chuàng)賽科技提供7601-54-9，磷酸鈉 一元Sodium phosphate monobasic for HPLC, ≥99.0%，商品編號：C13-17844-50g，價格586.62元。
2.溫度系數(shù)小硫酸銨的溶解度受溫度影響不大。例如0℃時，硫酸銨的溶解度仍可達到3.9mol/L(515g/L)。大約每升水可溶解676g。對于需要在低溫條件下進行酶的純化來說，應(yīng)用硫酸銨是有利的。上海創(chuàng)賽科技提供硫酸銨，Ammonium sulfate，≥99.997% metals basis，7783-20-2，商品編號：C16-A11026-10g，價格125元。
3.硫酸銨不易引起蛋白質(zhì)變性，對于很多種酶還有保護作用，且價格低廉，容易獲得。
硫酸銨的缺點是銨離子干擾雙縮脲反應(yīng)，為蛋白質(zhì)的定性分析造成一定困難。
(二) 鹽的濃度
分段鹽析法是通過改變鹽的濃度以達到分離目的。應(yīng)該將鹽的濃度準確地分步提高到各種蛋白質(zhì)所需的濃度。鹽的濃度常用飽和度表示，飽和溶液定為100%。調(diào)整硫酸銨溶液飽和度的方法有計算、查表兩種：
1.添加飽和溶液的計算法
如 S2為所需達到的飽和度，S1為原來的飽和度,V 為達到所需飽和度的溶液體積，Vo為原來的體積。則:
體積的改變造成的誤差小于2%，可以忽略不計。
2.查表法(表1-3)
可以從表中直接查到將1 升飽和度為S1的鹽溶液濃度提高到飽和度為S2的濃度時所需添加固體硫酸銨的重量(克)。
(三)pH值
如前所述，β值與溶液的pH 值有密切關(guān)系。當溶液的pH值達到蛋白質(zhì)等電點時，β值最小，蛋白質(zhì)的溶解度最低，最易從溶液中析出。因此在鹽析時，應(yīng)控制溶液的pH值使之接近蛋白質(zhì)的等電點。
(四)溫度
溫度對β值的影響不如對pH 值的影響顯著。因此，對溫度的要求不嚴格，低溫主
要是防止蛋白質(zhì)變性和降解。
(五)蛋白質(zhì)濃度
溶液中蛋白質(zhì)濃度愈高，鹽析所需的鹽飽和度愈低。所以，鹽析的蛋白質(zhì)濃度不宜過低，但過高的蛋白質(zhì)濃度也不適合，因其會和其它蛋白產(chǎn)生共沉淀作用而影響純度。
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