【基本原理】

　　在蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽至一定濃度時(shí),蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出，這種作用稱為鹽析，其機(jī)制與下列因素有關(guān)：蛋白質(zhì)分子表面水化層被破壞;蛋白質(zhì)分子所帶電荷被中和。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)，其性質(zhì)不變，經(jīng)透析或稀釋后仍可溶解。鹽析是可逆過程。在血清蛋白中，清蛋白占絕大部分，其余為球蛋白，在血清中加入硫酸銨至33%飽和時(shí)，γ-球蛋白被沉淀，依此可將γ-球蛋白分離出來，然后再用凝膠過濾法除鹽即可得到比較純的γ-球蛋白。

　　【器材】

　　1.層析柱

　　2.乳膠管

　　3.螺旋夾

　　4.橡皮塞

　　【試劑】

　　1.血清樣品。上海創(chuàng)賽科技提供標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，Standard Fetal Bovine Serum ，商品編號(hào)：B11-S9030-200ml，價(jià)格360元。

　　2.pH7.2飽和硫酸銨：用氨水將飽和硫酸銨溶液調(diào)至pH7.2。

　　3.磷酸鹽緩沖液-生理鹽水(PBS)：用0.01mol/L 磷酸緩沖液(pH7.2)配制的0.9%NaCl溶液。上海創(chuàng)賽科技提供7601-54-9，磷酸鈉 一元Sodium phosphate monobasic for HPLC, ≥99.0%，商品編號(hào)：C13-17844-50g，價(jià)格586.62元。

　　4.納氏試劑。上海創(chuàng)賽科技提供納氏試劑A液，商品編號(hào)：C49-14205-100ml，價(jià)格266元。

　　5.雙縮脲試劑：CuSO4.5H2O 0.39g, 酒石酸鉀鈉1.2g分別溶于50ml水中，2.5N NaO60ml, KI 0.2g 與上述溶液混勻，加水至200ml。

　　【操作步驟】

　　1.血清蛋白的鹽析

　　(1)將血清1.0ml 加入離心管中，加PBS液1.0ml，混勻，再逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨1.0ml 邊加邊搖勻，靜置30min 后3000rpm離心10min，傾去上清(此液主要含清蛋白)。

　　(2)將離心管中的沉淀用1.0ml PBS液攪拌溶解，再逐滴加入飽和硫酸銨溶液0.5ml混勻，靜置30min，3000rpm離心10min，傾去上清(主要含α,β球蛋白)，其沉淀即為初步純化的γ-球蛋白。若要得到更純凈的γ-球蛋白，可以重復(fù)此過程1-2次。

　　2.脫鹽

　　(1)凝膠制品的預(yù)處理：取Sephadex G50 1g，放入100ml 燒杯中，加蒸餾水50ml，于沸水浴中煮沸1h ，冷卻后傾去上清液，再加入PBS 10ml 備用。

　　(2)裝柱：關(guān)閉出口，將Sephadex G50懸液混勻自層析柱頂部加入，待凝膠在柱中沉淀1-2cm高時(shí)，打開出口，同時(shí)不斷加入凝膠，直至距頂部2cm 左右。繼續(xù)用PBS流洗整個(gè)柱床，控制其流速為1ml/min。操作過程中嚴(yán)防出現(xiàn)氣泡或分層。如床面不平，可用玻璃棒輕輕攪動(dòng)表層，使凝膠重新自然沉降(整個(gè)過程中，切勿使液面低于床面，以免氣體進(jìn)入，使柱床干裂)。

　　(3)加樣：將床面以上的液體放出，待液面恰好與凝膠面重合時(shí)，關(guān)閉下口。用滴管吸取γ-球蛋白液，緩慢沿內(nèi)壁加入(盡量不擾動(dòng)凝膠面)。打開出口，使樣品進(jìn)入柱內(nèi)，再陸續(xù)小心加入PBS液。

　　(4)收集：準(zhǔn)備12 只小試管收集流出液，從加樣后開始，每管收集1ml。將收集液經(jīng)280nm波長測(cè)定后，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，作出洗脫圖譜。

　　(5)檢測(cè)：準(zhǔn)備二塊反應(yīng)板，向各孔內(nèi)加入收集液各1滴，其中一塊板各孔內(nèi)分別加入納氏液一滴，有NH4+者呈黃色至橙色。再向另一反應(yīng)板各孔內(nèi)加入雙縮脲試劑各一滴，觀察雙縮脲反應(yīng)并記錄呈色深淺，用(-或+)表示。PDF

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