【基本原理】

　　一個混合蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳以后，各組分由于電泳遷移率不同而被分離。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身而言主要與分子量以及所帶凈電荷和形狀有關。當電泳體系中含有一定濃度的SDS時，電泳遷移率的大小僅取決于蛋白質(zhì)的分子量(其它影響因素可忽略不計)，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。

　　SDS(十二烷基硫酸鈉)是一種陰離子去污劑，能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)部、分子之間以及與其它物質(zhì)分子之間的非共價鍵, 使蛋白物變性而改變原有的空間構(gòu)象。當有強還原劑(如巰基乙醇)存在使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原，并且SDS 的總量為蛋白質(zhì)量的3～10 倍、SDS 單位濃度大于1mol/L 時。這兩者的結(jié)合是定量的，大約每克蛋白質(zhì)可結(jié)合1.4克SDS。蛋白質(zhì)分子一經(jīng)結(jié)合了一定量的SDS陰離子，所帶負電荷的量遠遠超過了它原有電荷量。從而消除了不同種類蛋白質(zhì)間電荷的差異，且由于分子量越大的蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS越多、帶負電荷也越多,這就使各蛋白質(zhì)-SDS復合物的電荷密度趨于一致;同時，不同蛋白質(zhì)的SDS 復合物形狀也相似，均是長橢圓狀。因此，在電泳過程中，遷移率就取決于蛋白質(zhì)-SDS 復合物的大小，也可以說是取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。

　　據(jù)經(jīng)驗得知，當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在17 000-165 000之間時。蛋白質(zhì)-SDS復合物的電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)呈線性關系：

　　lgMW=lgK-bm

　　式中MW 為蛋白質(zhì)的分子量，m 為相對遷移率，K 為常數(shù)，b 為斜率。將已知分子量的標準蛋白質(zhì)在SDS -聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率對分子量的對數(shù)作圖，即可得到一條標準曲線。只要測得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)標準曲線求得其分子量。

　　【器材】

　　1.電泳儀

　　2.垂直板電泳槽

　　3.微量進樣器

　　4.乳頭吸管

　　5.50ml小燒杯

　　【試劑】

　　1.貯備液的配制

　　(1)30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29.2g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，棕色瓶4℃保存。

　　(2)1.5mmol/LTris-Cl分離膠緩沖液，pH8.8(4×)：稱取18.15g Tris，用1NHCl調(diào)pH至8.8，加水至100ml，4℃保存。

　　(3)1.0mmol/L Tris-Cl濃縮膠緩沖液，pH6.8(4×)：稱取5.98g Tris，用1NHCl調(diào)pH至6.8，加水至100ml，4℃保存。

　　(4)電極緩沖液(pH8.3)：取14.40g甘氨酸，3.00g Tris，加10ml 10%SDS，加水至1L，4℃保存。

　　(5)10% SDS：取10g SDS，加水至100ml ，完全溶解后室溫保存。

　　(6)10%過硫酸銨溶液(AP)：臨用前現(xiàn)配，或配好后-20℃分裝凍存。

　　(7)染色液(0.25%考馬斯亮藍R-250、50%甲醇、7%乙酸)：考馬斯亮藍R-250 2.5g，甲醇500ml、70ml 冰乙酸，加水至總體積1000ml(甲醇可用無水乙醇代替)。

　　(8)脫色液(30%甲醇、7%乙酸)：甲醇300ml，冰乙酸70ml，加水至1000ml(也可用無水乙醇代替甲醇)。

　　(9)樣品緩沖液(2×)：H2O 2.4ml，濃縮膠緩沖液1.0ml、甘油0.8ml、10% SDS

　　3.2ml，2-硫基乙醇0.4ml。0.025%(W/V)溴酚蘭0.2ml。

　　(10)TEMED

　　2.工作液的配制

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