【基本原理】

　　重組DNA 分子需導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞(真核或原核細(xì)胞)才能進(jìn)行復(fù)制，增殖和表達(dá)。用于分子克隆技術(shù)中的受體細(xì)胞為大腸桿菌K-12 的衍生菌(DH5α等)。細(xì)菌處于易于吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。用理化方法可誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入感受態(tài)。本實(shí)驗(yàn)使用化學(xué)法(CaCl2)處理處于生長對數(shù)期的DH5α細(xì)胞，使其對外源DNA的通透性增加，以達(dá)到外源DNA 分子導(dǎo)入細(xì)菌中的目的。

　　【器材】

　　1.高壓滅菌鍋

　　2.培養(yǎng)皿

　　3.恒溫培養(yǎng)搖床

　　4.離心機(jī)

　　【試劑】

　?、?細(xì)菌：DH5α

　　2.30 mmol/L CaCl2(滅菌)

　　3.LB培養(yǎng)基：配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950 ml去離子水中加入：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g

　　搖動容器直至溶解，用5mol/L NaOH (約0.2ml )調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L，高壓滅菌20min 。

　　4.LB 瓊脂培養(yǎng)基：先按上述配方配制液體培養(yǎng)基，臨高壓滅菌前加入瓊脂 16～18 g。

　　【操作步驟】

　　1.將DH5α菌種在瓊脂培養(yǎng)平板上畫線，37℃培養(yǎng)12-16h。

　　2.從平板上挑取1個單菌落，移入含2ml LB的試管中，在37℃條件下，以220rpm的速度振蕩培養(yǎng)12-16h。

　　3.將2ml LB培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含50 ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃培養(yǎng)2-3h，使其OD600值在0.3-0.6之間 (即細(xì)胞處于對數(shù)生長期)。

　　4.將培養(yǎng)物于冰上放置10min , 離心(3000-4000rpm, 4℃) 10min, 收集細(xì)菌。

　　5.棄上清, 在沉淀中加入10ml 預(yù)冷的30mmol/L CaCl2 懸浮細(xì)菌, 在冰上放置40-60min 。

　　6.離心(3000-4000rpm, 4℃) 10min , 回收細(xì)菌。

　　7.棄上清, 將細(xì)菌重新懸浮于2 ml 預(yù)冷的30mmol/L CaCl2溶液中。

　　8.感受態(tài)細(xì)菌于48h內(nèi)使用, 或?qū)⒁阎苽浜玫母惺軕B(tài)細(xì)菌分裝凍存(-70℃)。

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