大腦中動(dòng)脈阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO) 是目前最常用的局灶性腦缺血模型，MCAO 模型先阻斷頸外動(dòng)脈(ECA)及其分支，且阻斷翼腭動(dòng)脈(PPA)，以切斷顱外來(lái)源的側(cè)副循環(huán)血流。從ECA 插入尼龍線，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)到大腦前動(dòng)脈(ACA)，機(jī)械性阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA) 發(fā)出處的血供來(lái)建立大腦中動(dòng)脈缺血模型。此模型可在無(wú)麻醉狀態(tài)下拔出尼龍線，恢復(fù)血流，實(shí)現(xiàn)再灌注。 線栓法具有不開顱、效果肯定、可準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)，用于研究神經(jīng)元對(duì)缺血的敏感性、耐受性，藥物療效觀察以及再灌注損害和治療時(shí)間窗較為理想，同時(shí)也具有對(duì)全身影響小、動(dòng)物存活時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，適于慢性腦損傷的研究?？刂坪靡鬃円蛩兀杀苊鈱?shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性。
1、主要器材
(1)缺血前準(zhǔn)備：腦立體定位儀、(小鼠適配器)、微量注射泵、微量注射器、顱鉆
(2)缺血模型制作：氣體麻醉機(jī)、異氟烷、體視顯微鏡、冷光源、手術(shù)臺(tái)、術(shù)后保溫箱、腦模具、手術(shù)器械包
(3)缺血模型評(píng)價(jià)：神經(jīng)功能評(píng)價(jià)法(BBB評(píng)分)、TTC染色、病理學(xué)評(píng)價(jià)
(4)缺血后行為檢測(cè)：抓力測(cè)試儀、轉(zhuǎn)棒儀......
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
(1)SPF級(jí)Wistar大鼠，健康，雄性，體重為250-300g。
(2)SPF級(jí)C57小鼠，健康，雄性，體重為18 - 25g，實(shí)驗(yàn)Protocol和視頻，請(qǐng)點(diǎn)擊觀看和下載: Click Here
3、實(shí)驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)分六組：正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、受試藥組三個(gè)劑量組，每組15只動(dòng)物。
4、建模方法(以大鼠為例)
(1)1.5-2%異氟烷氣體麻醉大鼠，頸部備皮，消毒，插入肛溫探頭，保持體溫在37±0.5℃。
(2)頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。使用6-0絲線在距離頸總動(dòng)脈分叉4mm處結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，在頸外動(dòng)脈穿入另一根6-0絲線，在靠近頸總動(dòng)脈分叉處打一個(gè)活結(jié)。
(3)使用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈。在距離頸總動(dòng)脈分叉處3mm處的頸外動(dòng)脈上剪一個(gè)小口，將一根頭端處理過(guò)的0.33mm直徑的尼龍線從小口中插入，進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，并向內(nèi)插入大腦中動(dòng)脈，尼龍線的插入深度距離頸總動(dòng)脈分叉處約16±1mm。
(4)缺血后90min拔掉線栓，用6-0絲線結(jié)扎外動(dòng)脈近心端，用3-0絲線縫合頸部傷口，活力碘消毒傷口，將大鼠放在加熱墊上，待清醒后放入恒溫?fù)狃B(yǎng)箱飼養(yǎng)。
(5)術(shù)后24h，對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，然后繼續(xù)麻醉大鼠，取大腦切片、進(jìn)行TTC染色和病理染色。
5、模型的評(píng)價(jià)
(1)神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分
參考 Longa 及Bederson 的5 分制法在動(dòng)物麻醉清醒后24h 進(jìn)行評(píng)分，分值越高,說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。
0 分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀
1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪
2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈
3分：向?qū)?cè)傾倒
4分：不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失
(2)TTC染色
麻醉大鼠后 ，取大鼠腦組織 ，放入 -20 ℃冰箱冷凍 30min 30min。用 PBS配置 1% TT C(W/V )，37 ℃水浴至 TTC 溶解， 將凍好的腦組織切片 ，置于 10ml TTC 溶液 中， 37 ℃恒溫孵育 10min。不時(shí)翻動(dòng)腦片，使 組織均勻染色。正常腦染色后呈鮮紅，而梗死區(qū)呈蒼白。
附：小鼠缺血2h后TTC染色效果圖，如下：
(3)病理學(xué)評(píng)價(jià)
取腦后用 4% 多聚甲醛溶液 固定，蔗糖溶液脫水后經(jīng) 固定，蔗糖溶液脫水后經(jīng) 固定，蔗糖溶液脫水后經(jīng) OCT 包埋做冰凍切片 ，包埋做冰凍切片 ，10um ， 做尼氏染色， 做尼氏染色可做梗死面積的評(píng)價(jià)。
