ELISA技術(shù)應(yīng)用概覽和方法學(xué)開發(fā)初析
簡(jiǎn)簡(jiǎn)介介
本文適用于已有過(guò)ELISA應(yīng)用相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)ELISA問(wèn)題排查和方法開發(fā)有進(jìn)一步需求的廣大科研人員，更加適用于ELISA相關(guān)醫(yī)療診斷試劑盒開發(fā)，體內(nèi)藥代藥動(dòng)相關(guān)大分子檢測(cè)，抗體結(jié)合活性質(zhì)控等在合規(guī)方面有方法學(xué)驗(yàn)證要求的藥物研發(fā)工業(yè)領(lǐng)域從業(yè)者。ELISA檢測(cè)技術(shù)的間接性，應(yīng)用領(lǐng)域的廣泛性，樣品來(lái)源的復(fù)雜性和試劑各成分反應(yīng)過(guò)程的可逆性導(dǎo)致ELISA的方法開發(fā)和實(shí)際的使用過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)各種異常情況，本文的目的是區(qū)分ELISA的使用目的，明確目的相關(guān)ELISA方法的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分步解析ELISA間接檢測(cè)的信號(hào)傳遞過(guò)程以及傳遞偏差對(duì)檢測(cè)方法的影響，簡(jiǎn)略探討免疫反應(yīng)（配體-受體結(jié)合）的化學(xué)本質(zhì)和數(shù)學(xué)原理，并重新評(píng)估棋盤法在ELISA方法開發(fā)的指導(dǎo)意義，倡導(dǎo)以使用目的為導(dǎo)向通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證為目標(biāo)的ELISA方法學(xué)開發(fā)。
ELISA應(yīng)用
ELISA檢測(cè)技術(shù)早在19世紀(jì)70，80年代就開發(fā)出來(lái)用于替代放射性同位素標(biāo)記技術(shù)用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用（配體-受體，抗原-抗體），到如今已經(jīng)接近50年的歷史了。這個(gè)技術(shù)從科研的角度來(lái)說(shuō)已經(jīng)不具備第一性，沒(méi)有太多的價(jià)值，不值得專門進(jìn)行研究，更多的是一個(gè)使用的工具。工業(yè)應(yīng)用落后于基礎(chǔ)研究，ELISA技術(shù)在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用隨著近20年生物制藥領(lǐng)域的迅猛發(fā)展展現(xiàn)著越來(lái)越多的使用價(jià)值，當(dāng)然ELISA的應(yīng)用情況也越來(lái)越復(fù)雜，這樣的復(fù)雜性也使得早期的基礎(chǔ)研究并不再具有很好的指導(dǎo)意義，ELISA方法濫用錯(cuò)用往往導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)系統(tǒng)性偏差，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，做出錯(cuò)誤的選擇。本文的寫作目的旨在作為文獻(xiàn)之外關(guān)于ELISA實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)總結(jié)，反補(bǔ)基礎(chǔ)研究的不足，使得該技術(shù)更具使用價(jià)值。
從早期抗體發(fā)現(xiàn)階段，雜交瘤的滴度測(cè)定，噬菌體展示的淘選篩選；抗體的穩(wěn)轉(zhuǎn)，瞬轉(zhuǎn)和發(fā)酵過(guò)程的表達(dá)量監(jiān)控，體外抗體和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白或細(xì)胞表面受體的親和力評(píng)價(jià)，細(xì)胞因子的監(jiān)控，體內(nèi)抗體藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，藥效生物標(biāo)志物的含量檢測(cè)和免疫原性測(cè)定等均會(huì)使用ELISA技術(shù)。ELISA技術(shù)可以說(shuō)是一個(gè)通用的，入門十分簡(jiǎn)單，應(yīng)用面十分廣泛，高通量的技術(shù)。小木蟲，丁香園等關(guān)于ELISA的問(wèn)題經(jīng)久不衰，ELISA技術(shù)由于其檢測(cè)的間接性（信號(hào)進(jìn)行了多重傳遞），使用目的的差異性和樣品來(lái)源的復(fù)雜性導(dǎo)致ELISA方法一旦出現(xiàn)異常實(shí)驗(yàn)地操作者很多時(shí)候很難進(jìn)行問(wèn)題排除。小編有過(guò)多年的ELISA相關(guān)應(yīng)用方法學(xué)的開發(fā)經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行了多個(gè)ELISA應(yīng)用的開發(fā)和方法學(xué)驗(yàn)證，從一個(gè)ELISA方法開發(fā)和ELISA平臺(tái)技術(shù)搭建者的角度，對(duì)ELISA方法應(yīng)用進(jìn)行梳理和系統(tǒng)分析。
使用目的
從使用目的來(lái)說(shuō)，ELISA方法可以分為兩類。第一類：生物大分子的定量，第二類：親和力測(cè)定評(píng)價(jià)或者篩選。抗體的穩(wěn)轉(zhuǎn)、瞬和發(fā)酵過(guò)程的表達(dá)量監(jiān)控，細(xì)胞因子的監(jiān)控，體內(nèi)抗體藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，藥效生物標(biāo)志物的含量檢測(cè)和免疫原性測(cè)定等可劃分為第一類使用目的，雜交瘤的滴度測(cè)定，噬菌體展示的淘選篩選，體外抗體和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白或細(xì)胞表面受體的親和力評(píng)價(jià)可劃分為第二類使用目的。使用目的不一樣，即使使用同樣的試劑材料，也會(huì)有不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ胶蛿M合曲線。下面小編將以某抗體的定量的方法開發(fā)（第一類目的）和親和力檢測(cè)方法開發(fā)（第二類目的）為例，對(duì)不同使用目的開發(fā)策略進(jìn)行介紹。
該方法的檢測(cè)體系如下，靶點(diǎn)蛋白（抗原）包被，樣品（人抗體）進(jìn)行反應(yīng)，酶聯(lián)二抗為羊抗人HRP偶聯(lián)多抗，顯色液為TMB顯色液。使用目的是對(duì)樣品進(jìn)行定量和親和力分析。
如表一，表二，采用相同的試劑材料，不同的試劑相對(duì)濃度得到了如圖1不一樣的劑量曲線來(lái)滿足不同的使用目的。而兩個(gè)方法最核心的不同在于包被抗原的量相對(duì)于梯度稀釋樣品的量，如果一個(gè)ELISA需要達(dá)到精密，準(zhǔn)確等驗(yàn)證需求，在定量方法的開發(fā)過(guò)程中包被抗原的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)品（樣品）的量，這樣樣品能夠抵消抗原抗體可逆反應(yīng)的影響，使得近似所有的抗體樣品均被捕捉到，標(biāo)準(zhǔn)曲線如果做對(duì)數(shù)線性擬合能夠得到非常好的線性。在親和力評(píng)價(jià)中，這跟同位素標(biāo)記測(cè)配體受體的親和力的原理一致，包被少量的包被抗原，采用飽和浸潤(rùn)法即包被抗原的量相對(duì)于樣品的量是由遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于抗原的量到遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抗原的量的過(guò)程，需要有完整的上下漸進(jìn)線，S型曲線，其EC50即親和力數(shù)值（解離平衡常數(shù)）。兩個(gè)使用目的采取的實(shí)驗(yàn)條件涉及到抗原抗體可逆反應(yīng)化學(xué)原理的數(shù)學(xué)推導(dǎo)，鑒于多寫一個(gè)數(shù)學(xué)公式可能會(huì)使讀者少上不少，公式推導(dǎo)已做省略，不同使用目的的假設(shè)推導(dǎo)過(guò)程也給出，有志于深耕ELISA領(lǐng)域的讀者可以好好研究下。
采用相同的實(shí)驗(yàn)材料，不同的試劑配比以分別達(dá)到生物大分子定量和親和力評(píng)價(jià)的使用目的并進(jìn)行對(duì)比的研究，至目前為止，小編并未在任何文獻(xiàn)上見(jiàn)到過(guò)類似的研究，但是在實(shí)際的應(yīng)用過(guò)程中達(dá)到了很好的效果，這也是小編想把這篇文章寫下來(lái)，期望借助互聯(lián)網(wǎng)的力量把這個(gè)不具有很大的科學(xué)價(jià)值但是有很廣泛的使用價(jià)值的技術(shù)進(jìn)行傳播討論，達(dá)到越辯越明的目的。
ELISA方法的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)
當(dāng)然，從一個(gè)藥物研發(fā)從業(yè)者的角度來(lái)看，開發(fā)出來(lái)的方法需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，符合相關(guān)法律法規(guī)后才能夠確認(rèn)成功，這是從質(zhì)量分析控制的尺度去對(duì)一個(gè)ELISA方法進(jìn)行評(píng)估，可以說(shuō)是最為嚴(yán)格的評(píng)估方式。這個(gè)工作可能主要集中在質(zhì)量控制相關(guān)的部門，涉及到一個(gè)檢驗(yàn)方法好壞的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，小編正好也負(fù)責(zé)過(guò)幾個(gè)ELISA方法的驗(yàn)證工作，簡(jiǎn)單介紹下，涉及到相關(guān)的法律法規(guī)，具體實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和程序以法規(guī)為準(zhǔn)。
生物大分子定量方法學(xué)驗(yàn)證
ELISA方法的第一類使用目的是生物大分子定量，這個(gè)可以參考2015版中國(guó)藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國(guó)FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation。里面有比較細(xì)致關(guān)于生物大分子定量方法的準(zhǔn)確度，精密度，線性和范圍，耐用性等方面的驗(yàn)證要求。在小編看來(lái)，在ELISA 定量開發(fā)出來(lái)后如果初步判斷一個(gè)檢測(cè)方法能否通過(guò)驗(yàn)證，主要看兩點(diǎn)，第一點(diǎn)是標(biāo)準(zhǔn)品的曲線擬合后的回測(cè)偏差是否在比較合適和穩(wěn)定范圍內(nèi)（最佳±10%），第二就要看標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品在檢測(cè)體系中是否具有相同的免疫學(xué)特性（平行性）。這個(gè)可以通過(guò)梯度稀釋樣品信號(hào)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)稀釋倍數(shù)校正后測(cè)定的濃度值在各稀釋倍數(shù)是否吻合來(lái)判斷。相同的免疫學(xué)特性是一個(gè)非常重要的概念，也是一個(gè)方法開發(fā)是否成功的關(guān)鍵。免疫學(xué)特性不僅僅指的待測(cè)樣品和包被抗原的親和力特性，也包含待測(cè)樣品和酶聯(lián)抗體的親和力特性。即使是同樣的物質(zhì)，當(dāng)樣品經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝循環(huán)后其免疫學(xué)特性有可能發(fā)生改變，那么未經(jīng)體內(nèi)代謝的對(duì)照品是否能夠作為標(biāo)準(zhǔn)品需要經(jīng)過(guò)平行性驗(yàn)證。即使不同的物質(zhì)，只要有相同的免疫學(xué)特性，也能夠進(jìn)行準(zhǔn)確定量，小編就搭建了雙抗Fc方法(包被為抗Fc抗體，酶聯(lián)抗體也為抗Fc抗體-HRP)作為通用方法，IGg作為對(duì)照品進(jìn)行多個(gè)抗體和融合蛋白的常規(guī)檢測(cè)，經(jīng)過(guò)分子量校準(zhǔn)后的檢測(cè)結(jié)果和純化后紫外的檢測(cè)結(jié)果有可比性。
親和力測(cè)定驗(yàn)證（相對(duì)結(jié)合活性方法學(xué)驗(yàn)證）
親和力指得是抗體和靶點(diǎn)抗原的解離平衡常數(shù)，是一個(gè)非常重要的生物特性。在質(zhì)量控制過(guò)程中，常用ELISA方法進(jìn)行不同批次或者長(zhǎng)期穩(wěn)定性樣品的親和力評(píng)價(jià)。親和力一般來(lái)說(shuō)是絕對(duì)值，但是由于生物實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，材料批次的替換可能會(huì)影響到樣品的親和力檢測(cè)準(zhǔn)確性，常會(huì)引入一個(gè)默認(rèn)質(zhì)量屬性不會(huì)變化的對(duì)照品作為參比品，待測(cè)樣品和參比品一同進(jìn)行檢測(cè)來(lái)抵消材料造成的偏差，并計(jì)算待測(cè)樣品相對(duì)于參比品的親和力（相對(duì)結(jié)合活性）
生物功能學(xué)方法的評(píng)價(jià)中國(guó)藥典目前沒(méi)有詳細(xì)的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，只有宏觀的分析方法準(zhǔn)確度，精密度，線性和范圍，耐用性等要求，F(xiàn)DA在USP1032,USP1033,USP1034有比較詳細(xì)和完整的生物功能學(xué)方法驗(yàn)證方案設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的案例，可以用來(lái)評(píng)價(jià)ELISA建立的親和力評(píng)價(jià)方法的質(zhì)量。
系統(tǒng)分析：信號(hào)進(jìn)行了多重傳遞和傳遞過(guò)程可能出現(xiàn)的偏差
ELISA是一個(gè)間接的檢測(cè)過(guò)程，這在很多文獻(xiàn)資料上都有這樣的記載。但是很少有研究資料詳細(xì)的描述間接測(cè)量的信號(hào)傳遞過(guò)程，以及傳遞過(guò)程中出現(xiàn)的偏差。這里小編從宏觀和微觀兩個(gè)角度對(duì)ELISA進(jìn)行系統(tǒng)分析，該分析有助于搭建穩(wěn)定的ELISA平臺(tái)，并正確地使用和評(píng)估不同性質(zhì)的酶聯(lián)抗體和顯色液等通用材料。
如圖2所示，宏觀上來(lái)講，ELISA檢測(cè)的函數(shù)曲線在實(shí)際操作過(guò)程中描述的是劑量濃度的抗體和信號(hào)之間的相關(guān)關(guān)系，而其實(shí)質(zhì)是為了描述劑量濃度的抗體和對(duì)應(yīng)抗原-抗體偶聯(lián)物之間的相關(guān)關(guān)系?？乖?抗體偶聯(lián)物經(jīng)過(guò)了酶聯(lián)抗體反應(yīng)和酶催化放大反應(yīng)，催化產(chǎn)物檢測(cè)后轉(zhuǎn)換成信號(hào)。該信號(hào)間接的代表了抗原-抗體偶聯(lián)物。這種間接的轉(zhuǎn)化過(guò)程經(jīng)歷了三重信號(hào)的傳遞過(guò)程，而只有在三重傳遞保證線性的情況，抗體濃度-信號(hào)劑量曲線才能等同于抗體濃度-抗體抗原偶聯(lián)物濃度劑量曲線，如果進(jìn)行了非線性傳遞將會(huì)影響到整個(gè)檢測(cè)方法的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，下面小編將從微觀角度簡(jiǎn)單介紹下信號(hào)傳遞過(guò)程中可能存在的偏差。
1.信號(hào)檢測(cè)偏差：酶催化產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成信號(hào)時(shí)有可能會(huì)產(chǎn)生的偏差，這個(gè)偏差在一些文獻(xiàn)中也稱之為儀器的非線性檢測(cè)區(qū)域，即當(dāng)酶催化產(chǎn)物濃度過(guò)高時(shí)，催化產(chǎn)物濃度和信號(hào)值之間不完全呈線性關(guān)系，這個(gè)現(xiàn)象是普遍存在的，如圖3所示某品牌酶標(biāo)儀的參數(shù)性能，注意該儀器的測(cè)量范圍是0-4 OD，而該儀器確保的檢測(cè)線性范圍是0-3 OD。一般來(lái)講在進(jìn)行吸光度法讀數(shù)時(shí)，檢測(cè)的信號(hào)值最高值控制在3左右。如果兩個(gè)相鄰的抗體濃度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的信號(hào)值在OD值3.5及以上時(shí)都會(huì)特別接近，這兩個(gè)信號(hào)值很有可能是有信號(hào)傳遞偏差的。這個(gè)可以通過(guò)高濃度的酶催化產(chǎn)物梯度稀釋查看信號(hào)的線性范圍確認(rèn)。
2.酶催化反應(yīng)傳遞偏差：該偏差是由酶催化顯色液引起的，其實(shí)質(zhì)是酶聯(lián)抗體的濃度和其對(duì)應(yīng)催化產(chǎn)物的濃度是否線性相關(guān)。如圖4所示由于酶催化反應(yīng)在未終止前是一個(gè)持續(xù)反應(yīng)的信號(hào)放大過(guò)程，信號(hào)的產(chǎn)生是時(shí)間的累積量，在反應(yīng)過(guò)程中酶活可能會(huì)喪失（左），顯色液的有效成分在不斷的減少時(shí)，梯度濃度的酶催化反應(yīng)在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的可能不會(huì)是勻速反應(yīng)狀態(tài)（右）。
這個(gè)可以通過(guò)動(dòng)力學(xué)讀數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。目前市面上有多種顯色液可供選擇，顯色能力最強(qiáng)和最弱的產(chǎn)品信號(hào)差異可能達(dá)到20-50倍，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的正確的選擇顯色液并確認(rèn)酶催化過(guò)程的線性傳遞。
3.酶聯(lián)抗體反應(yīng)傳遞偏差，即酶聯(lián)抗體和抗體抗原偶聯(lián)物反應(yīng)后，酶聯(lián)抗體-抗原抗體偶聯(lián)物的濃度能否線性的代表抗體抗原偶聯(lián)物的濃度。這個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程，主要是因?yàn)槊嘎?lián)抗體的異質(zhì)性導(dǎo)致的，酶聯(lián)抗體多為多抗，該抗體偶聯(lián)上的HRP分子數(shù)目也存在差異，很難用單一的實(shí)驗(yàn)去論證這個(gè)線性過(guò)程。但值得注意的是，酶聯(lián)抗體加入反應(yīng)濃度應(yīng)該遠(yuǎn)大于抗體抗原偶聯(lián)物的濃度，這樣能夠保證基本所有的抗體抗原偶聯(lián)物都被轉(zhuǎn)換成酶聯(lián)抗體-抗原抗體偶聯(lián)物，酶聯(lián)濃度加入過(guò)少會(huì)導(dǎo)致劑量曲線的高濃度點(diǎn)出現(xiàn)假平臺(tái)期，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；酶聯(lián)濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致非特異信號(hào)的增加，還有酶聯(lián)濃度的增加會(huì)導(dǎo)致信號(hào)的增加，可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)值超過(guò)線性檢測(cè)范圍。所以酶聯(lián)濃度的反應(yīng)濃度是一個(gè)值得選擇的參數(shù)。
免疫反應(yīng)（配體-受體結(jié)合）的化學(xué)本質(zhì)和數(shù)學(xué)原理解析
如果一個(gè)ELISA實(shí)驗(yàn)間接的檢測(cè)過(guò)程保證信號(hào)的線性傳遞，我們就可以研究下抗體和抗原這樣一個(gè)可逆反應(yīng)的過(guò)程，以及其化學(xué)原理，數(shù)學(xué)原理和假設(shè)。
假設(shè)我們考慮的是不涉及多步反應(yīng)的簡(jiǎn)單的可逆反應(yīng)的過(guò)程。即Ag和Ab反應(yīng)生成二元復(fù)合物Ab·Ag，Ag，Ab，Ab·Ag之間地可逆反應(yīng)，正反應(yīng)是二級(jí)反應(yīng)，其反應(yīng)速率常數(shù)為Kon，逆反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)，即逆反應(yīng)速率常數(shù)為Koff，即：
Ab:包被的酶標(biāo)板條上的固定抗體 Ag：分析物
[Ab]:包被在酶標(biāo)板條上的固定抗體的含量
[Ag]:待檢測(cè)的分析物的含量
[Ab·Ag]: Ag和Ab反應(yīng)后形成的偶聯(lián)物的含量
[Ag]f:反應(yīng)進(jìn)程中，尚未和Ab結(jié)合的自由地Ag的含量
[Ab]f:反應(yīng)進(jìn)程中，尚未和Ag結(jié)合的自由地Ab的含量
Kd= KoffKon 1.0
Ab·Ag的生成速度可表示為公式1.1
d[Ab·Ag]dt = Kon[Ag]f[Ab]f 1.1
Ab·Ag的解離速度可表示為公式1.2
-d[Ab·Ag]dt = Koff[Ab·Ag] 1.2
由1.0-1.2可以進(jìn)行簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)推導(dǎo)得到下面兩個(gè)公式（推導(dǎo)過(guò)程略）
即：
[Ab·Ag] =Ag [Ab]fKd+ [Ab]f 1.8.1
或[Ab·Ag] =Ab [Ag]fKd+ [Ag]f 1.8.2
假設(shè)：[Ab]? [Ag]，則[Ab]?[Ab·Ag]，則 [Ab]f= [Ab] - [Ab·Ag]≈[Ab]，1.8.1可轉(zhuǎn)換成
[Ab·Ag]=Ag [Ab]Kd+ [Ab] =[Ag]KdAb+1 1.9
當(dāng)[Ab·Ag]=1/2 [Ag] 時(shí)，Kd=[Ab] 1.10
假設(shè)：[Ag]? [Ab]，則[Ag]?[Ab·Ag]，則 [Ag]f= [Ag] - [Ag·Ab]≈[Ag]，
1.8.2可轉(zhuǎn)換成
[Ab·Ag]=Ab [Ag]Kd+ [Ag] =[Ab]KdAg+1 1.11
如果：[Ag]? Kd 則Kd/[Ag]≈ 0 , 公式1.11可轉(zhuǎn)換為
[Ab·Ag]≈[Ab]， 1.12
即檢測(cè)到的[Ab·Ag]的量約等于[Ab]的量
兩邊取log以消除不同濃度點(diǎn)的方差差異得
Log[Ab·Ag]≈Log [Ab] 1.13
[Ab·Ab]只有經(jīng)過(guò)酶聯(lián)抗體反應(yīng)和酶催化反應(yīng)的線性放大后才能得到
Log(OD)=a Log [Ab] + b 1.14
這樣一個(gè)數(shù)學(xué)推導(dǎo)過(guò)程并不困難，如果短時(shí)間內(nèi)不能理解可以看后續(xù)的討論
兩個(gè)假設(shè)具有十分重要的指導(dǎo)意義在于：
如為得到1.9的公式所做的假設(shè)，公式1.8.1只有當(dāng)包被的抗原的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于加入反應(yīng)的抗體的濃度時(shí)，劑量曲線的EC50的抗體濃度值才能代表抗體抗原間的親和力常數(shù)Kd。這個(gè)即ELISA親和力檢測(cè)方法模型，經(jīng)歷了一重假設(shè)。該假設(shè)是包被的抗原的濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少量。
為得到1.14的公式，所做的假設(shè)，公式1.8.2只有當(dāng)包被的抗原的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于加入反應(yīng)的抗體的濃度時(shí)，且包被的抗原的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Kd值時(shí)劑量曲線的才能進(jìn)行對(duì)數(shù)擬合（文章之初用四參數(shù)擬合代替對(duì)數(shù)擬合是另一個(gè)故事，有機(jī)會(huì)再講）。這個(gè)即ELISA定量檢測(cè)方法模型，經(jīng)歷了二重假設(shè)。該假設(shè)分別是包被的抗原的濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于反應(yīng)抗體的濃度，包被的抗原的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Kd（親和力，解離平衡常數(shù)），在這兩個(gè)假設(shè)中包被的抗原的濃度都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量，抗體和抗原的Kd要越小(強(qiáng)親和力)。
ELISA方法開發(fā)之棋盤法
小編在上文中初步區(qū)分ELISA的使用目的，明確目的相關(guān)ELISA方法的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分步解析ELISA間接檢測(cè)的信號(hào)傳遞過(guò)程以及傳遞偏差對(duì)檢測(cè)方法的影響，探討免疫反應(yīng)（配體-受體結(jié)合）的化學(xué)本質(zhì)和數(shù)學(xué)原理解析，現(xiàn)在我們來(lái)看看文獻(xiàn)資料對(duì)ELISA方法開發(fā)的指導(dǎo)，截止目前為止小編看到的對(duì)于ELISA方法開發(fā)的指導(dǎo)均是經(jīng)典的教科書式的棋盤法。
如表三所示，棋盤滴定法即將包被抗原和酶聯(lián)抗體分為作橫縱系列稀釋，待檢測(cè)樣品（對(duì)照品）加入高，低和零濃度進(jìn)行反應(yīng)，在一塊96孔板中進(jìn)行多個(gè)條件的排列組合，通過(guò)檢測(cè)的信號(hào)值即零樣品組的背景信號(hào)值小于0.1，低濃度組有和背景信號(hào)區(qū)分的信號(hào)值，高濃度組的信號(hào)值和背景信號(hào)有比較大的信噪比來(lái)選擇合適的條件。
在實(shí)際的操作過(guò)程中，根據(jù)這樣的標(biāo)準(zhǔn)能夠選出多個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的條件組合（黃色區(qū)域和藍(lán)色區(qū)域），這樣的方法在ELISA方法開發(fā)的初期并未起到很好的指導(dǎo)意義。選擇其中的一個(gè)條件組合繼續(xù)走下去進(jìn)行方法的開發(fā)可能最終通不過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，然后重新進(jìn)行另一個(gè)條件組合的嘗試和方法學(xué)驗(yàn)證，是一個(gè)十分低效的過(guò)程。
ELISA方法開發(fā)之初析
如何進(jìn)行高效地進(jìn)行一個(gè)方法學(xué)開發(fā)？
首先小編認(rèn)為我們需要明確ELISA方法開發(fā)的目的，如之前的化學(xué)原理分析和數(shù)學(xué)推導(dǎo)，如果是進(jìn)行大分子定量，包被的抗原遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量是方法穩(wěn)定的必然選擇；如果是進(jìn)行ELISA的親和力分析，包被的抗原少量是方法穩(wěn)定的必然選擇。這樣也就減少了一個(gè)變量，排除了大部分的可能。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，96孔板一個(gè)孔的抗原載量是有限的，如果是進(jìn)行定量方法的開發(fā)，包被的抗原濃度為5μg/ml，100μl足以過(guò)量，而進(jìn)行親和力方法開發(fā)，常用的包被的抗原濃度為100ng/ml，100μl或者200ng/ml，100μl.
其次要做好平臺(tái)的搭建工作，確認(rèn)通用的顯色液和酶聯(lián)抗體等試劑在信號(hào)傳遞過(guò)程中是否有可能存在偏差，即信號(hào)檢測(cè)偏差，酶催化反應(yīng)偏差和酶聯(lián)反應(yīng)偏差。
第三是熟悉不同使用目的的ELISA方法的方法學(xué)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。在方法學(xué)開發(fā)的初期就是以通過(guò)驗(yàn)證為最終目標(biāo)進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)。
展望
以上只是一個(gè)簡(jiǎn)而概之的進(jìn)行ELISA方法開發(fā)的描述，作為一門實(shí)驗(yàn)技術(shù)還需要在正式的實(shí)驗(yàn)操作中去體會(huì)，很多不同廠商來(lái)源的酶標(biāo)板材，酶聯(lián)抗體和顯色液，樣品的復(fù)雜程度等均會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的效果，需要實(shí)驗(yàn)人員去了解各試劑耗材的物性，駕馭好信號(hào)值的大小變化。一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)?zāi)０鍟?huì)少走很多彎路，節(jié)省很多不必要的花費(fèi)，小編能夠保證的是文章開篇的定量方法開發(fā)和親和力方法開發(fā)的實(shí)例是一個(gè)比較好的模板以供參考。需要說(shuō)明的是本文描述的均是非競(jìng)爭(zhēng)法條件下進(jìn)行ELISA方法學(xué)開發(fā)，競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行定量和親和力檢測(cè)有更加復(fù)雜的機(jī)理和更多的變量條件需要確認(rèn)，這是另一個(gè)故事。
ELISA是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的技術(shù)，其整個(gè)方法過(guò)程中經(jīng)歷了多重的信號(hào)傳導(dǎo)，間接的檢測(cè)過(guò)程使得該方法在實(shí)際使用過(guò)程中充滿了迷霧，一個(gè)宏觀全局的把控認(rèn)知和微觀細(xì)微的分步實(shí)驗(yàn)分析是搭建好一個(gè)可以進(jìn)行多方面應(yīng)用ELISA平臺(tái)的關(guān)鍵。在小編看來(lái)ELISA實(shí)驗(yàn)方法不是“一千個(gè)人眼中有一千個(gè)哈姆雷特”，而是”所有幸福的家庭是相似的;每個(gè)不幸的家庭各有各的不幸”。
