高效液相色譜法與氣相色譜法一樣，都屬于色譜法，具有：選擇性高、分離效率高、靈敏度高、分析速度快等特點。本文就兩種色譜法的應(yīng)用范圍、儀器構(gòu)造等不同點做出比較。

　　氣相與液相的概念

　　氣相

　　氣相色譜是一種物理的分離方法。利用被測物質(zhì)各組分在不同兩相間分配系數(shù)（溶解度）的微小差異，當兩相作相對運動時，這些物質(zhì)在兩相間進行反復多次的分配使原來只有微小的性質(zhì)差異產(chǎn)生很大的效果而使不同組分得到分離。

　　液相

　　高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上引用了氣相色譜的理論。在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬）；同時，柱后連有高靈敏度的檢測器可對流出物進行連續(xù)檢測。

　　應(yīng)用范圍

　　氣相

　　分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等。受技術(shù)條件的限制，沸點太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進行分析，一般對500℃以下不易揮發(fā)或受熱易分解的物質(zhì)部分可采用衍生化法或裂解法。

　　液相

　　高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此，不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大（大于400以上）的有機物（些物質(zhì)幾乎占有機物總數(shù)的75%～80%）。原則上，都可應(yīng)用高效液相色譜法來進行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計，在已知化合物中能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。

　　氣相儀器構(gòu)造

　　氣相

　　由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均在控制狀態(tài)。

　　1. 柱箱：

　　色譜柱是氣相色譜儀的心臟，樣品中的各個組份在色譜柱中經(jīng)過反復多次分配后得到分離，從而達到分析的目的，柱箱的作用就是安裝色譜柱。由于色譜柱的兩端分別連接進樣器和檢測器，因此，進樣器和檢測器的下端（接頭）均插入柱箱。柱箱能夠安裝各種填充柱和毛細管柱并且操作方便。色譜柱（樣品）需要在一定的溫度條件下工作，因此，采用微機對柱箱進行溫度控制，并且由于設(shè)計合理，柱箱內(nèi)的梯度很小。

　　對于一些成份復雜、沸程較寬的樣品，柱箱還可進行三階程序升溫控制。且程序設(shè)定后自動運行無需人工干預，降溫時還能自動后開門排熱。

　　2. 進樣器：

　　進樣器的作用是將樣品送入色譜柱。如果是液體樣品，進樣器還必須將其汽化。因此，采用微機對進樣器進行溫度控制。

　　根據(jù)不同種類的色譜柱及不同的進樣方式，共有五種進樣器可供選擇：

• 填充柱進樣器

• 毛細管不分流進樣器附件

• 毛細管分流進樣器附件

• 毛細管分流/不分流進樣器

• 六通閥氣體進樣器

　　3. 檢測器：

　　檢測器的作用是將樣品的化學信號轉(zhuǎn)化為物理信號（電信號）。檢測器也需要在一定的溫度條件下才能正常工作，因此，采用微機對檢測器進行溫度控制。

　　根據(jù)各種樣品的化學物理特性，共有五種檢測器可供選擇：

• 氫火焰離子化檢測器（FID）；

• 熱導檢測器（TCD）；

• 電子捕獲檢測器（ECD）；

• 氮磷檢測器（NPD）；

• 火焰光度檢測器（FPD）；

　　4. 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：

　　該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

　　高效液相儀器構(gòu)造

　　液相

　　高效液相色譜儀主要有：進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。

　　1. 進樣系統(tǒng)

　　一般采用：隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。

　　2. 輸液系統(tǒng)

　　該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47～4.4×107Pa流速可調(diào)且穩(wěn)定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、pH值或改用。

　　3. 分離系統(tǒng)

　　該系統(tǒng)包括：色譜柱、連接管和恒溫器等。

　　色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管）內(nèi)徑為2～5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成），固定相中的基質(zhì)是由機械強度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性（如，硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性和比表面積大的特點，加之其表面經(jīng)過機械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣）或者用化學法偶聯(lián)各種基因（如，磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。

　　因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性，例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。

　　另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小、微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。

　　這也進一步證明基質(zhì)粒度小，會提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60℃通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。

　　4. 檢測系統(tǒng)

　　高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種：

　　(1)紫外檢測器

　　該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。

　　其特點：使用面廣（如，蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10g/mL）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

　　(2)示差折光檢測器

　　凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測；糖類化合物的檢測使用此檢測系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強、操作簡單，但是，靈敏度低（檢測下限為10-7g/mL），流動相的變化會引起折光率的變化；因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。

　　(3)熒光檢測器

　　凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物（如，多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14g/mL）痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。

　　5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

　　該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

　　高效液相色譜與氣相色譜法

　　優(yōu)點和不足分析

　　只有20%樣品可不經(jīng)化學處理而能滿意地用氣相色譜分離，80%的有機化合物要用高效液相色譜分析。

　　氣相色譜中流動相是惰性的，它對組分沒有作用力，僅起運載作用、而高效液相色譜的流動相不僅起運載作用，而且流動相對組分有一定親合力，可以通過改變流動相種類和組成提高分離的選擇性；另外，可作流動相的化合物多，選擇余地廣。

　　與氣相色譜相比，高效液相色譜儀的另一個優(yōu)點是：樣品的回收比較容易，只要開口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集?；厥帐嵌康?，可以用來提純和制備具有足夠純度的單一物質(zhì)。

　　高效液相色譜不足的是，日前，檢測器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應(yīng)”對柱效率及色譜分離的影響。