什么是引物（Primers）？
引物是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)中使用的短單鏈DNA序列。在PCR方法中，使用一對(duì)引物與樣品DNA雜交并確定將被擴(kuò)增的DNA區(qū)域。引物也被稱為寡核苷酸（Oligonucleotides）。
引物具備哪些特性？
引物的主要特性是需要與模板分子上的序列相對(duì)應(yīng)（需要與模板鏈互補(bǔ)）。
引物有長短之分。短引物主要用于擴(kuò)增小而簡單的DNA片段，而長引物用于擴(kuò)增真核基因組DNA樣本。引物不宜過長（>30-mer primers）或過短。過短的引物會(huì)產(chǎn)生不準(zhǔn)確的非特異性DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，過長的引物會(huì)導(dǎo)致雜交速率降低。平均而言，需要擴(kuò)增的DNA片段大小應(yīng)該在1-10KB以內(nèi)。
引物結(jié)構(gòu)要相對(duì)簡單，不含內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免內(nèi)部折疊。同時(shí)，還需要避免“Primer-Primer”退火（Annealing），這種退火會(huì)產(chǎn)生引物二聚體（primer dimers）并破壞擴(kuò)增過程。設(shè)計(jì)時(shí)，如果不確定要在引物的某個(gè)位置放置什么核苷酸（nucleotide），可以在該位置包括多個(gè)核苷酸，稱為混合位點(diǎn)（mixed site）。也可以使用基于核苷酸的分子插入物（肌苷，inosine）來代替常規(guī)核苷酸，以實(shí)現(xiàn)更廣泛的配對(duì)能力。
18-24個(gè)堿基的長度；
G/C含量在40-60%
起止于1-2G/C對(duì)；
熔化溫度（Tm）為50-60℃；
引物對(duì)之間的Tm應(yīng)在5℃之內(nèi)；
引物對(duì)不應(yīng)該有互補(bǔ)區(qū)域。
Step 1 粘貼引物序列
點(diǎn)擊Primers→Add Primer...然后復(fù)制粘貼序列。
Step 2 選擇綁定位點(diǎn)（可選）
或者，可以從在序列上選擇所需的綁定站點(diǎn)開始。點(diǎn)擊鼠標(biāo)并拖動(dòng)以進(jìn)行選擇，相應(yīng)引物的熔化溫度就會(huì)顯示出來。在所選位置添加引物，Primers→Add Primer。
Step 3 選定底鏈或頂鏈（可選）
若引物是從選定的結(jié)合位點(diǎn)制成的，需要指定是選擇Top Strand還是Bottom Strand。
Step 4 引物命名
如有需要，可以為引物命名，方便后續(xù)管理。
Step 5 輸入描述
如有需要，可以輸入詳細(xì)描述。Description頁簽是默認(rèn)打開的。
Step 6 修改引物
如需要，可以修改引物以增加一個(gè)5'擴(kuò)展或引入突變。SnapGene提供兩種方法：
一種是在文本框中手動(dòng)編輯引物序列；
另一種是在變更位置單擊引物序列，然后單擊Insertions選項(xiàng)卡。使用對(duì)話框控件添加所需的密碼子、限制位點(diǎn)、或肽編碼序列。
Step 7 查看結(jié)合部位和熔化溫度
結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目和計(jì)算的熔化溫度顯示在窗口的底部。點(diǎn)擊對(duì)話框右下角的藍(lán)色文本，可以看到熔化溫度計(jì)算方法的總結(jié)。
Step 8 查看引物
點(diǎn)擊Add Primer to Template可以查看新的引物。
Step 9 選擇多個(gè)引物
如要批量編輯多個(gè)引物，先選中目標(biāo)引物。打開Edit Primers對(duì)話框，點(diǎn)擊Primers→Edit Primers。
Step 10 確認(rèn)改動(dòng)點(diǎn)
如上圖選擇想要修改的引物顏色、磷酸化、和字體、然后點(diǎn)擊OK。
Step 11 查看更新的引物
可以看到更新后的引物，如上面序列視圖舉例，引物的顏色被更改為紅色。
而在上面Map視圖中，可以看到更新顏色后的引物有圓點(diǎn)標(biāo)記。
