單細(xì)胞測序在疾病診斷和細(xì)胞異質(zhì)性研究中發(fā)揮著重要作用，單細(xì)胞測序已經(jīng)讓我們能以全新的方式理解細(xì)胞的生化過程。然而目前的單細(xì)胞測序手段需要將細(xì)胞消化并裂解才能夠進(jìn)行，而細(xì)胞狀態(tài)在這一操作中不可避免的會發(fā)生改變，因此很難掌握細(xì)胞真實的基因表達(dá)情況。近日，來自中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院研究員陳萬澤以第一作者身份在國際期刊Nature上發(fā)表長文，使用多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM創(chuàng)建了一種原位活細(xì)胞基因測序方法Live-Seq，這種方法能夠在不殺死細(xì)胞的情況下完成對細(xì)胞的測序工作。通過這種技術(shù)該團(tuán)隊成功完成單細(xì)胞RNA基因測序，并通過這種方法檢測到了細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞周期狀態(tài)變化。下面本文就這項工作的具體內(nèi)容進(jìn)行闡述。
1. Live-Seq測序技術(shù)簡述
由于單個細(xì)胞的RNA總量僅有10 pg。為了實現(xiàn)無損的單細(xì)胞測序，陳老師的團(tuán)隊首先使用FluidFM對現(xiàn)有的scRNA-Seq單細(xì)胞測序的方法進(jìn)行了優(yōu)化。為了盡可能的接近Smart-Seq的測試條件，團(tuán)隊采用了首先將緩沖液吸入探針，然后再進(jìn)行細(xì)胞提取的操作。這樣可以確保所提取的RNA能夠第一時間與緩沖液混合，從而避免RNA的降解。通過這一方法，該團(tuán)隊成功實現(xiàn)了IBA細(xì)胞的測序，證明了這種方法的可行性（圖1）。
圖1. Live-Seq技術(shù)
a. Live-Seq技術(shù)的示意圖和代表圖片，黑色箭頭指液體位置；b. IBA細(xì)胞測序的質(zhì)量控制圖（n=10）。
2. Live-Seq技術(shù)分析細(xì)胞系和細(xì)胞狀態(tài)
為了證實Live-Seq的有效性，陳老師團(tuán)隊對多種細(xì)胞系進(jìn)行了測序，這其中包括IBA細(xì)胞、小鼠脂肪干細(xì)胞和祖細(xì)胞（ASPCs）以及脂多糖處理的RAW264.7細(xì)胞和Mock處理的RAW264.7細(xì)胞。通過對這些細(xì)胞系進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，該方法能夠區(qū)分上述細(xì)胞系，并且在特征基因檢測中能夠找到每種細(xì)胞所對應(yīng)的特征基因，證明了Live-Seq方法的有效性（圖2）。
圖2. Live-Seq單細(xì)胞測序區(qū)分細(xì)胞型及細(xì)胞狀態(tài)
3. Live-Seq技術(shù)對細(xì)胞的活力基本沒有影響
Live-Seq技術(shù)的優(yōu)勢在于提取過程中不會破壞細(xì)胞。通過對提取前后的測序?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn)，提取組與空白組之間的團(tuán)簇沒有顯著性差異。并且通過對細(xì)胞形態(tài)的觀察中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)基本沒有改變，并且多數(shù)細(xì)胞仍然能夠正常分裂（圖3）。
圖3. Live-Seq對細(xì)胞活力的影響
a. 細(xì)胞實驗的示意圖；b. Live-Seq測序后不同時間點（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE圖；
4. Live-Seq技術(shù)能夠記錄細(xì)胞下游分子表型事件
由于Live-Seq對細(xì)胞生理狀態(tài)影響小，因此能夠監(jiān)測在細(xì)胞代謝過程中的基因變化。通過對比LPS處理的巨噬細(xì)胞周期實驗中發(fā)現(xiàn)，Live-Seq技術(shù)與對照組的細(xì)胞代謝水平相比沒有明顯變化，因此這種方法測量的數(shù)據(jù)十分接近細(xì)胞代謝中基因表達(dá)的真實水平。通過測序?qū)Ρ萀PS處理與空白的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nfkbia與Tnf的表達(dá)非常相關(guān)。這一結(jié)果也驗證這種測序方法在檢測細(xì)胞下游表型時的優(yōu)勢。
圖4. Live-Seq技術(shù)的單細(xì)胞縱向分析
5. Live-Seq技術(shù)對同一細(xì)胞多次測序
Live-Seq技術(shù)的無損性甚至能夠?qū)崿F(xiàn)對單個細(xì)胞的多次測序。通過對單個細(xì)胞兩次提取后細(xì)胞活力變化的觀察中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的活力即使在2次提取后仍沒有發(fā)生明顯的變化，基因型分析也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的基因表型改變。
圖5. Live-Seq對細(xì)胞的多次提取，連續(xù)測序的示意圖和代表圖像；整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE圖。
6. 總結(jié)
Live-Seq是一種十分具有前景的單細(xì)胞測序的新方法，得益于FluidFM技術(shù)的無損提取的優(yōu)勢，Live-Seq技術(shù)除了能夠?qū)崿F(xiàn)傳統(tǒng)測序的功能外，還降低了細(xì)胞的損傷，能夠提供更加原生和真實的測序信息。這種特點甚至讓單細(xì)胞的基因表達(dá)動力學(xué)研究成為可能。相信隨著這種技術(shù)自動化的提高，將為單細(xì)胞測序技術(shù)帶來更多可能。
參考文獻(xiàn)：
[1] Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Pernille Yde Rainer, Christoph G. G?belein, Wouter Saelens, Vincent Gardeux, Amanda Klaeger, Riccardo Dainese, Magda Zachara, Tomaso Zambelli, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, Nature(2022); DOI: 10.1038/s41586-022-05046-9
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