投稿方: 馬爾文儀器公司

　　標(biāo)題：共振質(zhì)量測(cè)試法在生物制藥開發(fā)中的應(yīng)用

　　作者：Lisa Newey-Keane博士，馬爾文儀器生物制藥產(chǎn)品經(jīng)理

　　本公司文號(hào)：MAL/JOB/2720

　　字?jǐn)?shù): 2286

　　圖片：共4張(僅在文件末尾提供縮略圖，高分辨率圖片文件另行提供)

　　圖1：在流體中測(cè)量粒子質(zhì)量

　　圖2：共振質(zhì)量測(cè)試儀器的配置(阿基米德系統(tǒng)，馬爾文儀器)

　　圖3：(自左至右)(a)，(b)及(c)：利用馬爾文阿基米德系統(tǒng)進(jìn)行聚集體檢測(cè)

　　圖4：區(qū)分蛋白質(zhì)聚集體和受污染硅油液滴的能力的展示

　　共振質(zhì)量測(cè)試法在生物制藥開發(fā)中的應(yīng)用

　　作者：Lisa Newey-Keane博士，馬爾文儀器生物制藥產(chǎn)品經(jīng)理

　　預(yù)測(cè)和測(cè)量蛋白質(zhì)聚集，是生物制藥配方中的一個(gè)重大難題。Lisa Newey-Keane博士描述了一種新型分析方法，可以方便地研究蛋白質(zhì)的聚集。

　　由于在藥物研發(fā)總體經(jīng)費(fèi)支出中，生物分子研究工作所占的比重越來越大，因此分析測(cè)試在迅速發(fā)展的生物制藥行業(yè)受到廣泛關(guān)注。這些分子開發(fā)不僅成本高昂，而且受到嚴(yán)格監(jiān)管，所以急需更適合、更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治鰷y(cè)量方法。很多業(yè)內(nèi)人士都提到，分析瓶頸是一個(gè)很令人擔(dān)心的問題，可能會(huì)限制藥物的開發(fā)。

　　與小分子藥物不同，蛋白質(zhì)制劑是非合成或非結(jié)晶的，且本質(zhì)上是不均勻的。正因?yàn)槿绱?，?duì)生物療法的純度和效力做出判定，要比對(duì)非生物分子復(fù)雜得多。例如，雜質(zhì)來源繁多，包括以聚集體、錯(cuò)誤折疊構(gòu)象，或是以變性結(jié)構(gòu)形式存在的生物分子。因此，用于保證和控制質(zhì)量并提供預(yù)配方和配方必要數(shù)據(jù)所需的分析技術(shù)與制藥業(yè)中的用于小分子藥物的分析技術(shù)不同。這種復(fù)雜性和多變性，不僅給制造商，同樣也給監(jiān)管機(jī)構(gòu)帶來了許多新的挑戰(zhàn)。

　　挑選合適的候選分子會(huì)在其它分析中涉及各種物理化學(xué)測(cè)試過程，以排除那些有可能成為下游“問題分子”的分子。其中一個(gè)需要回答的重要的問題是，這些分子將會(huì)在配方中有怎樣的表現(xiàn)。而值得關(guān)注的重要領(lǐng)域是蛋白質(zhì)聚集體，以及聚集可能引發(fā)的免疫反應(yīng)。

　　監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)明確表達(dá)了對(duì)直徑為0.2微米至2微米的蛋白質(zhì)聚集體造成的潛在免疫原性的關(guān)注，但現(xiàn)有的粒徑測(cè)定技術(shù)，尚不足以提供這一范圍的量化數(shù)據(jù)。它們可以讓你知道有這種粒徑的粒子存在，但無法確定存在的數(shù)量。被應(yīng)用于馬爾文阿基米德系統(tǒng)的諧振質(zhì)量測(cè)定(RMM )技術(shù)能彌補(bǔ)這一缺陷，因?yàn)樗粌H可以進(jìn)行粒徑測(cè)量，更重要的是能對(duì)直徑為50納米 - 5微米的粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)。

　　技術(shù)簡(jiǎn)介

　　共振質(zhì)量測(cè)量主要是依靠一個(gè)可以檢測(cè)質(zhì)量變化的機(jī)械共振結(jié)構(gòu)。質(zhì)量增加或減少，可以使結(jié)構(gòu)的共振頻率上升或下降。由于可對(duì)頻率進(jìn)行非常的測(cè)定，這就為測(cè)量質(zhì)量提供了基礎(chǔ)。為了測(cè)量懸浮在液體上的微小顆粒的質(zhì)量，共振器內(nèi)置了微流體通道。當(dāng)懸浮顆粒通過該結(jié)構(gòu)時(shí)，它會(huì)改變共振器的整體質(zhì)量，由此改變其共振頻率。如圖1所示，顆粒在位置1時(shí)進(jìn)入共振器。當(dāng)顆粒到達(dá)共振器末端的位置2時(shí)，對(duì)共振頻率造成的偏移達(dá)到值。而當(dāng)顆粒在位置3退出時(shí)，共振頻率又恢復(fù)到基準(zhǔn)線。

　　通過測(cè)量共振頻率對(duì)基準(zhǔn)線的偏移，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)粒子質(zhì)量的測(cè)量。對(duì)于具有上浮力的微粒，如油滴(見下文)，則可以觀測(cè)到相反的效果，共振頻率會(huì)相對(duì)于基準(zhǔn)線發(fā)生正偏移。

　　采用共振質(zhì)譜測(cè)量非常小的顆粒，需要使用自身質(zhì)量很小的共振器。在馬爾文阿基米德系統(tǒng)中，MEMS(微機(jī)電系統(tǒng))傳感器能滿足這一要求。每個(gè)傳感器芯片包括一個(gè)微流體網(wǎng)絡(luò)和一個(gè)微小的懸臂，以一個(gè)特定的頻率發(fā)生共振。懸臂中內(nèi)置一個(gè)微流體通道。當(dāng)儀器中的流體系統(tǒng)將樣品推送經(jīng)過通道時(shí)，懸臂的共振頻率會(huì)發(fā)生變化。共振頻率的變化通過激光測(cè)量，先聚焦到懸臂的頂端，然后將其發(fā)送到一個(gè)分離光電二管探測(cè)器。

　　每個(gè)粒子穿過傳感器都會(huì)引起一次共振頻率的變化，從而得到對(duì)樣品中單個(gè)顆粒浮力質(zhì)量精準(zhǔn)的測(cè)量，無論這個(gè)數(shù)據(jù)是正是負(fù)。通過這樣的測(cè)量，可以計(jì)算出粒子的質(zhì)量、粒徑(等效球)以及表面積。同時(shí)也可對(duì)樣品濃度、密度、體積和多分散性進(jìn)行整體測(cè)量。

　　蛋白質(zhì)聚集體的定量測(cè)量

　　起初，蛋白質(zhì)聚集體處于二聚體水平，此后直徑一路攀升到數(shù)十微米，高于這一范圍上部的聚集體通常采用流量式顯微鏡來測(cè)量。共振質(zhì)量測(cè)量可應(yīng)用于低于流式顯微鏡測(cè)量范圍的領(lǐng)域，包括那些粒徑在亞微米至幾微米、以及不易通過其他方法評(píng)估定量評(píng)估測(cè)量的粒徑。這也是免疫原性的影響之處，以及新的監(jiān)管要求關(guān)注的地方。

　　圖3(a)為 4 μL配制緩沖液中，亞微米級(jí)IgG蛋白聚集體的粒度分布狀況。

　　使用RMM測(cè)量得出，粒徑大于300納米的聚集體濃度為每毫升4×106。因?yàn)闇y(cè)量是基于質(zhì)量的，粒度分布可以用形成每種聚集體(圖3(b))的蛋白質(zhì)分子(已知質(zhì)量的)數(shù)量來表示。圖3(c)中列出的是，提高剪切應(yīng)力一段時(shí)間后，對(duì)蛋白質(zhì)樣品的測(cè)量結(jié)果，并圖示出了在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，從300nm到1μm范圍內(nèi)聚集體的濃度在增長(zhǎng)。這種尺寸的聚集體出現(xiàn)10倍的增加，大致對(duì)應(yīng)一條聚集體級(jí)聯(lián)，而亞微米聚集體的濃度與壓力下制劑質(zhì)量的不好有關(guān)。

　　檢測(cè)污染物

　　蛋白質(zhì)制劑分析中另一個(gè)流行的課題是硅油，它通常作為潤(rùn)滑劑，存在于盛制劑的注射器和容器中。硅油常常會(huì)混入制劑中，形成與聚集體大小接近的油滴。但主要問題不是生物相容性，因?yàn)楣栌偷瓮ǔ１徽J(rèn)為是安全的。更大的問題在于，在某些測(cè)量方法中，油滴會(huì)被誤認(rèn)為是蛋白聚集體，因此有可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　RMM可以通過浮力測(cè)量將硅油滴與蛋白質(zhì)聚集體區(qū)分開來。例如，在圖4中，密度大于懸浮緩沖液的聚集體，是用頻率軌跡中的負(fù)峰值來表示。

　　硅油滴的密度一般比緩沖液的密度低，會(huì)在頻率軌跡上形成正峰值，這是因?yàn)樗鼈兊拇嬖诮档土藗鞲衅鞯恼w質(zhì)量，從而提高傳感器的共振頻率。每一組都提供了單獨(dú)的分布情況。

　　今日技術(shù)

　　常規(guī)分析儀器使用過程中， RMM技術(shù)應(yīng)用和推行成功至為關(guān)鍵的原因，在于它解決了蛋白質(zhì)聚集測(cè)量中的關(guān)鍵粒度范圍這一問題。同樣重要的是，在處理小劑量貴重材料時(shí)，只需100 μL粘度達(dá)到100 cP的樣品，且無需進(jìn)行樣品制備，即可進(jìn)行測(cè)量。

　　由于能對(duì)50納米至5微米尺寸范圍內(nèi)的顆粒進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)數(shù)，以及對(duì)浮力質(zhì)量、干質(zhì)量和大小進(jìn)行可靠測(cè)量，共振質(zhì)譜測(cè)量成為蛋白特性鑒定吸引力的方案。有關(guān)配方和穩(wěn)定性的定量信息，可被轉(zhuǎn)化為對(duì)效能及其穩(wěn)定性的信息。目前，RMM已經(jīng)被用于生物制劑早期開發(fā)階段，對(duì)聚集體進(jìn)行檢測(cè)和量化，這實(shí)現(xiàn)了“發(fā)現(xiàn)越早，代價(jià)越小”的理念。

　　正文完

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　　圖1：在流體中測(cè)量粒子質(zhì)量

　　圖2：共振質(zhì)譜測(cè)量?jī)x器的配置(馬爾文阿基米德系統(tǒng))

　　圖3：(自左至右)(a)，(b)及(c)：利用馬爾文阿基米德系統(tǒng)進(jìn)行聚集體檢測(cè)

　　圖4：區(qū)分蛋白質(zhì)聚集體和受污染硅油液滴能力的展示