小課堂1222-158

　　一、貼壁細胞蛋白提取

　　A

　　1..將水浴鍋的溫度調(diào)至100℃，等水浴鍋達到100℃溫度后，取出需要收樣的細胞的培養(yǎng)皿或者孔板。

　　2.將緩沖液(1Xloading buffer)置于100℃水浴鍋中預熱10min。

　　(loding buffer： 是5Xloding buffer用純水稀釋到1Xlodingbuffer。廠家：碧云天;貨號： P0015L)

　　3.棄去細胞培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍。

　　4.取預熱好的緩沖液1X loding加入到去除細胞培養(yǎng)液的細胞中，用細胞刮將細胞掛下收集到EP管。

　　(加入loding buffer的體積建議量，以細胞密度長到70%-80%，6孔板每孔加入120ul;150px皿200ul;250px皿300ul)

　　5.將收集好的細胞液轉(zhuǎn)移到EP管中，立即放入100℃煮15min。

　　6.

　　B

　　1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。

　　2.每瓶細胞加 3 ml 4℃ 預冷的 PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將 PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

　　3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF(100 mM)，搖勻置于冰上。(PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。)

　　4.每瓶細胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。

　　5.裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動作要快)，然后用槍將細胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。(整個操作盡量在冰上進行。)

　　6.于 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min。(提前開離心機預冷)

　　7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 0.5 min 的離心管中放于-20℃ 保存。

　　(個人感覺上述方法可操作性有待加強，細胞中蛋白本來就很少，一瓶 50 ml 的細胞有時按照實驗要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液進行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。本人是先用預冷的 PBS(一般數(shù)毫升)加入后，用細胞刮刮下細胞，轉(zhuǎn)移至試管中，如果數(shù)瓶細胞是收集同一蛋白的，可以放在同一試管，離心后再將蛋白轉(zhuǎn)移到 EP 管中，這樣可操作性就比較強)

　　二、組織中總蛋白的提取：

　　1.將少量組織塊置于 1～2 ml 勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

　　2.加 400 μ 單去污劑裂解液裂(含 PMSF)于勻漿器中進行勻漿。然后置于冰上。

　　3.幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。

　　4.裂解 30 min 后，即可用移液器將裂解液移至 1.5 ml 離心管中，然后在 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min，取上清分裝于 0.5 ml 離心管中并置于-20℃ 保存。

　　三、加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提?。?

　　由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按(一)操作外還應收集培養(yǎng)液中的細胞。以下是培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提?。?

　　1.將培養(yǎng)液倒至 15 ml 離心管中，于 2500rpm 離心 5 min。

　　2.棄上清，加入 4 ml PBS 并用槍輕輕吹打洗滌，然后 2500rpm 離心 5 min。棄上清后用 PBS 重復洗滌一次。

　　3.用槍洗干上清后，加 100 μ 裂解液(含 PMSF)冰上裂解 30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細胞充分裂解。

　　4.將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起 4℃.12000rpm 離心 5 min，取上清分裝于 0.5 ml 離心管中并置于-20℃ 保存