二、ELISA原理及分類

　　1.ELISA的原理

　　ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。

　　2.ELISA的類型

　　ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：(1)固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"(immunosorbent);(2)酶標記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"(conjugate);(3)酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

　　2.2.1雙抗體夾心法測抗原

　　雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

　　1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

　　2)加受檢標本，保溫反應(yīng)。標本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

　　3)加酶標抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān)。

　　4)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標本中抗原的量。在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測。

　　2.2.2雙抗原夾心法測抗體

　　反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標記方法。

　　2.2.3間接法測抗體

　　間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法(見圖2-3)。操作步驟如下：

　　2.2.4競爭法測抗

　　當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。

　　2.2.5競爭法測抗原

　　小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

　　2.2.6捕獲包被法測抗體

　　IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM(其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM)。

　　2.2.7ABS-ELISA法

　　ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產(chǎn)物，標記方法頗為簡便。