Western Blot已經成為實驗室中檢測蛋白質的常規(guī)手段。不過想要得到一張條帶清晰、沒有雜帶、背景干凈的圖片，還是具有一定挑戰(zhàn)性的。我們在做蛋白電泳和Western Blot時，多數(shù)都用的Bio-Rad公司的儀器和abcam公司抗體，所以Bio-Rad蛋白方面的技術專家的確可以稱之為專家，因為每天都有很多人向他們請教。他們就將最常見的問題整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我們節(jié)選了一部分，希望能幫你節(jié)省一些查資料的時間。
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品牌 |
抗體名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
市場價 |
促銷價 |
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Abcam |
Anti-Chk2 (phospho T387) |
ab55319 |
100 µg |
3996.00 |
3196.00 |
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Abcam |
Anti-Chk1 [EPR3952] |
ab133277 |
100 µl |
4175.00 |
3340.00 |
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Abcam |
Anti-CDKN2A |
ab189034 |
50 µg |
3996.00 |
3196.00 |
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Abcam |
Anti-ATR抗體[2B5] |
ab4471 |
100 µg |
4255.00 |
3404.00 |
? Q：我的結果是膜上一片空白。為什么會這樣?
A：導致這種結果的因素很多。
膠和膜放反了 如果在轉印的過程中，膠和膜的位置顛倒了，那么蛋白就從膠上轉移到緩沖液中，而不會到達膜上。對于標準的轉印，凝膠應靠近三明治的負極，而膜對應正極。
轉膜效率低 轉膜效率受多種因素影響，包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場強度、轉印時間和緩沖液的pH值。一般說來，蛋白越大，轉移得越慢。轉移大蛋白最好的方法是用高的電場強度。而小蛋白長時間處于高電場強度下可能會穿出轉印膜。避免這個問題的方法是用0.2 um孔徑的NC膜或PVDF膜進行轉印。如果蛋白的等電點接近緩沖液的pH值，那么這個蛋白攜帶的電荷很少，在電場中也幾乎不移動。如果你的目的蛋白是強堿性的，那么你可以用碳酸鹽(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性緩沖液。
在轉印之后，你可以通過染膠或第二塊膜來判斷轉印效率。為了幫助你直接監(jiān)控轉印效率，Bio-Rad也提供了多種預染Marker，它們在電泳以及轉膜之后可直接觀察到。試劑放置太久或存放條件不正確 抗體會慢慢降解，如果反復凍融的話，它會快速降解。底物應儲存在-20°C。
抗體不純或滴度太低 一抗的濃度差異很大，應該根據(jù)經驗來決定一抗的稀釋度。過猶不及，太多的抗體也會阻礙抗原與抗體的結合。一般的原則是以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清。Bio-Rad的印跡級別的二抗稀釋度是1:3000。
酶失活了 疊氮鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。不要在HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結合的抗體中，而無副作用。另外，自來水或用聚苯乙烯樹脂去離子的水也可能會使酶失活，只能使用蒸餾的去離子水。
使用Tween-20洗滌 Tween-20(吐溫-20)可能會干擾某些抗體-抗體相互作用，或洗走NC膜上的目的蛋白。盡管在洗滌時它的終濃度只有0.05%-0.1%，但仍可能會影響結合。因此除了封閉之后的第一次洗滌，其他洗滌過程中都不使用Tween-20，不過，這可能會使背景升高。
檢測系統(tǒng)缺乏足夠的靈敏度 確保蛋白的上樣量在檢測系統(tǒng)的靈敏度范圍內：
辣根過氧化物酶 500 pg/band
堿性磷酸酶 100 pg/band
增強的堿性磷酸酶 5 pg/band
膠體金 100 pg/band
增強的膠體金 10 pg/band
Immun-Star 化學發(fā)光 10 pg/band
Q：我的western blot總是背景過高，如何解決?
A：背景過高可能是由很多因素引起的：封閉不完全、顯色過度、洗滌不充分、轉移緩沖液或設備有污染、抗體稀釋度不對或抗體不純。
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