一、利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列
因為密碼子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp(通過蛋白查蛋白)，在整個Nr數(shù)據(jù)庫中中查找與之相似的氨基酸序列。
二、對所找到的序列進(jìn)行多序列比對
將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，可選工具有Clustal W，也可在線分析
三、確定合適的保守區(qū)域
設(shè)計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區(qū)域，且兩個保守區(qū)域相距50～ 400個aa為宜，使得PCR產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個保守區(qū)域至少有6個aa殘基，因為每條引物至少18bp左右。若比對結(jié)果保守性不是很強(qiáng)很可能找不到6個aa的保守區(qū)域，這時可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進(jìn)行二次比對，若保守性仍達(dá)不到要求，則需進(jìn)行三次比對?？傊?，究竟要選多少序列來比對，要根據(jù)前一次比對的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個6個aa且兩者間距離合適的保守區(qū)域。
四、利用軟件設(shè)計引物
當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來設(shè)計引物了，其中pp5支持簡并引物的設(shè)計，將參與多序列比對的序列中的任一條導(dǎo)入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差以個核苷酸的序列群，該群可用一條有簡并性的核苷酸鏈來表示(其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W= A/T，H= A/C/T，B= C/G/T，V=A/C/G， D=A/G /T,N=A/C/G/T)，該具有簡并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對應(yīng)部分，在pp5中修改參數(shù)，令其在兩個距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對，總之要保證上下游引物都落在該簡并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會有數(shù)對，分?jǐn)?shù)越高越好。
在這里我們特別值得說明的是CODEHOP方法，該方法要求的保守區(qū)較短，而且能有效的降低引物的兼并度，是一種非常有效的方法。該方法主要是通過將簡并區(qū)放在3 末端，并在5 端設(shè)計一個一致性的區(qū)域來降低兼并度。
五、對引物的修飾
若得到的引物為：
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，則其簡并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡并度多高不利于pcr。我們可以通過用次黃嘌呤代替N(因為次黃嘌呤能很好的和4種堿基配對)和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡并度
設(shè)計出來簡并引物對，適用于用于比對的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。
由于引物的簡并性的問題，所設(shè)計的引物通常簡并性過高，導(dǎo)致有效引物利用率降低，PCR產(chǎn)物非特異性增高。
雖然減少簡并引物長度可以相對減少簡并性，但隨之而來的問題是引物的Tm值過低，有時不得不設(shè)計第二對引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增，即巢式PCR，或者需要與Touchdown PCR相結(jié)合使用。
與通常設(shè)計的簡并引物不同，利用CodeHop方法設(shè)計簡并引物。引物由兩部分組成：引物3’端為根據(jù)4-5個保守氨基酸設(shè)計的核心簡并區(qū)(3’core region)，長度只有11-15個堿基;引物5’端為非簡并性夾板結(jié)構(gòu)(5’consensus clamp region)。5’端夾板結(jié)構(gòu)是根據(jù)密碼子偏向性設(shè)計的一致性序列，它最大程度的預(yù)測了保守性氨基酸的編碼序列，其長度取決于所需的退火溫度。這樣設(shè)計的優(yōu)點在于既減少了引物的簡并度，又提高了引物的退火溫度，保障了PCR產(chǎn)物的特異性。標(biāo)準(zhǔn)簡并PCR在聚合反應(yīng)的晚期，隨著產(chǎn)物的增多，引物的非特異性結(jié)合的現(xiàn)象增多;而CodeHop PCR的晚期，這種現(xiàn)象大為減少。實驗結(jié)果表明，按這種方法設(shè)計的簡并引物非特異性擴(kuò)增減少，是一種快捷方便的簡并引物設(shè)計方案。
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