細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。
1. 大分子染色體DNA片段的測(cè)定
細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段。所有超過(guò)一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過(guò)凝膠半徑時(shí)，即達(dá)到分辨力的極限。此時(shí)凝膠不再按分子量的大小來(lái)篩分DNA，DNA像通過(guò)彎管一樣，以其一端指向電場(chǎng)一極而通過(guò)凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問(wèn)題。這個(gè)方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場(chǎng)。每當(dāng)電場(chǎng)方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場(chǎng)軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動(dòng)。DNA分子量越大，這種重排所需要的時(shí)間就越長(zhǎng)。當(dāng)DNA分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，DNA就可以按其分子量大小分開。
2.DNA Ladder 測(cè)定
方法：
?、偈斋@細(xì)胞(1X107)沉淀;
?、诩?xì)胞裂解液：13000rpm′5min， 收集上清;
?、?%SDS和RnaseA(5mg/ml)56°C， 2h;
?、艿鞍酌窴(2.5mg/ml)37°C，2h;上海創(chuàng)賽科技提供39450-01-6，蛋白酶K，Proteinase K，用于分子生物學(xué)，≥30 units/mg protein ,商品編號(hào)：C16-P10706-25mg，價(jià)格165元。
?、?/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無(wú)水乙醇沉淀DNA，4°C過(guò)夜?14000rpm′15min;上海創(chuàng)賽科技提供4418-26-2，脫氫醋酸鈉，99% ,商品編號(hào)：D16-1019891-100g，價(jià)格155元。
⑥最后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer;
?、?.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。
3.凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計(jì)分析
方法：
①收集細(xì)胞，70%冷乙醇(in PBS)4°C固定過(guò)夜，PBS洗滌;上海創(chuàng)賽科技提供重組人 RNase A，Ribonuclease A，RNASE1 蛋白 (His 標(biāo)簽)，Ribonuclease, RNase A family, 1 (pancreatic) Protein,商品編號(hào)：C86-134-68-50ug，價(jià)格2210元。
?、?000rpm′10min RNase A(0.5mg/ml)37°C消化30min PI(50mg/ml)染色，室溫避光15min;上海創(chuàng)賽科技提供957054-30-7，GDC-0941GDC0941>98%,有效的PI3Kα/δ抑制劑 ,商品編號(hào)：C84-4843-10mg，價(jià)格931元。
?、跢ACScan分析DNA亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變化。
4. ApoAlertTM LM-pcr Ladder Assay (CLONTECH)
優(yōu)點(diǎn)：敏感度高，適合于檢測(cè)少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞。如臨床活組織檢測(cè)。
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