Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基(17KD)和兩個(gè)小亞基(12KD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。

　　1. Western blot分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對(duì)底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]等的裂解。

　　方法：

　　收集細(xì)胞→PBS洗滌→抽提細(xì)胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2 h或4 °C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng)1~2 h或4 °C過夜→TBS-T(含0.05% Tween 20的TBS)洗3次，5~10 min/次→HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10 min/次→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。上海創(chuàng)賽科技提供SDS-PAGE蛋白質(zhì)低分子量標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE Molecular low weight markers for proteins 14400～97400，液體，即用型,商品編號(hào)：D23-RD1031-20次/100ul/支，價(jià)格144元。

　　2. 熒光分光光度計(jì)分析

　　原理：

　　活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。

　　方法：

　　收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞PBS洗滌制備細(xì)胞裂解液，加Ac-DEVD-AMC(caspase-3四肽熒光底物)37 °C反應(yīng)1 h熒光分光光度計(jì)(Polarstar)分析熒光強(qiáng)度(激發(fā)光波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為430-460 nm)。上海創(chuàng)賽科技提供169322-61-0，蛋白酶3底物1m，熒光Caspase 3 Substrate 1m(Apopain), fluorogenic; Ac-DEVD-AMC>95%,BR ,商品編號(hào)：C84-10931-5mg，價(jià)格551元。

　　3. 流式細(xì)胞術(shù)分析

　　方法：

　　收獲細(xì)胞正常或凋亡細(xì)胞PBS洗滌加Ac-DEVD-AMC37 °C反應(yīng)1hUV流式細(xì)胞計(jì)分析caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度。

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