TFAR19(PDCD5)是由本研究室在國際上首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素(FITC)標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細(xì)胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長時(shí)間，在凋亡小體中仍然可見。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸(PS)外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。
進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。
(一)TFAR19蛋白的細(xì)胞定位分析
材料試劑：
FITC標(biāo)記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T(pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20)，胎牛血清，熒光細(xì)胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。上海創(chuàng)賽科技提供多聚甲醛，30525-89-4，Paraformaldehyde ,T,88.0%,商品編號：C12-P0018-25G，價(jià)格109.25元。
儀器：
低溫水平離心機(jī), 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細(xì)胞計(jì)
方法：
1 懸浮細(xì)胞的染色：
(1)收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞(0.5~1′106)，PBS洗2次，1000rpm′10min。
(2)3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
(3)加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。上海創(chuàng)賽科技提供PBS-Tween20洗液，BR ,商品編號：D16-1028505-500ml，詢價(jià)。
(4)加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min。上海創(chuàng)賽科技提供標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，Standard Fetal Bovine Serum ,商品編號：B11-S9030-200ml，價(jià)格360元。
(5)加入5ml FITC標(biāo)記的TFAR19單抗(終濃度為1：40)，4°C反應(yīng)30min
(6)熒光細(xì)胞洗液洗2次，1000rpm 10min。
結(jié)果觀察：
將細(xì)胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。
2：貼壁細(xì)胞的原位染色：
(1) 貼壁生長的對數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中(內(nèi)有潔凈蓋玻片)，讓其爬片生長，待長到 50%~80%滿時(shí)，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。
(2) 將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上。
(3) 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油(5ml)的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微 鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。
3：臨床病理切片的染色、檢測。
4：原代細(xì)胞的培養(yǎng)、檢測。
5：分析TFAR19蛋白在人體內(nèi)各組織器官的分布及定位
(二)TFAR19蛋白的表達(dá)與臨床疾病
ELISA法檢測正常人和疾病狀態(tài)下，以及疾病的不同時(shí)期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
材料和試劑：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer 上海創(chuàng)賽科技提供緩沖液pH8.7(6mol/L的鹽酸胍),Buffer Solution(Guanidine Hydrochloride) ,商品編號：C12-B2904-100ML，價(jià)格598元。
2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 封閉液： 3%BSA(用洗滌液配制)
4. 酶標(biāo)抗體的稀釋：用封閉液稀釋
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g 檸檬酸 0.51g DDW 100ml
6. 顯色液(現(xiàn)配現(xiàn)用)：底物Buffer 10ml OPD 2mg 30% H2O2 2ml
7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標(biāo)記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA Reader(OD490nm)，洗板機(jī)
操作步驟
1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19(1mg/ml)包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過夜(一般24h以上)。
2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C 過夜。
3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清(3個(gè)重復(fù)孔)100ml/well ，37°C孵育1h。設(shè)包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照。
4. 洗滌Buffer洗板三次，加入1：2500稀釋的HRP標(biāo)記的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液，100 ml/well，避光反應(yīng)10~15min。
6. 加入H2SO4終止反應(yīng)，50 ml/well。
7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達(dá)水平。
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