防腐劑是化妝品工業(yè)中非常重要的部分。隨著化妝品種類和劑型的繁多, 及高科技生物原料應用的增加, 許多化妝品公司都在積極研究防腐劑問題( 包括其品種和使用濃度) , 并不斷建立新的防腐體系。在評價防腐劑的實際效果中, 應用最為廣泛和經(jīng)典的研究手段是微生物挑戰(zhàn)性試驗(m icrob ialchallenge test ing)。這種測試方法是根據(jù)化妝品生產(chǎn)和消費者使用中可能存在的污染(一次污染和二次污染) , 人為地將一定量的微生物(細菌和霉菌) 加入到產(chǎn)品中, 然后間隔一定時間分析該產(chǎn)品中防腐劑對微生物的作用, 按檢測期間加菌產(chǎn)品的含菌量來評判防腐劑的防腐效果與否或大小, 這種方法在評價防腐劑防腐效果上有很高的參考價值。
一、材料與方法
1、化妝品中常用的防腐體系
選擇了8 種化妝品中常用的防腐體系按常規(guī)方法加入膏霜內, 同時設2 個對照膏霜(不含任何防腐劑)。防腐體系1 是011% 國產(chǎn)菌霉克星; 體系2 是011% 國產(chǎn)菌霉克星、012% 尼泊金甲酯、011% 尼泊金丙酯; 體系3 是0104% 國產(chǎn)CY21; 體系5 是國產(chǎn)CY21、012% 尼泊金甲酯、011% 尼泊金丙酯; 體系5是傳統(tǒng)的尼泊金甲酯和丙酯與極美Ê 配伍; 防腐體系6、7 和8 是含同種防腐劑, 體系6 為低濃度, 體系7是高濃度, 體系8 是高濃度與其它防腐劑配伍。上海創(chuàng)賽科技提供尼泊金甲酯，對羥基苯甲酸甲酯,Methylparaben,>99%,USP，99-76-3,商品編號：C84-2041-25G，價格140元。
2、微生物挑戰(zhàn)性實驗
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細菌包括: 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、巨大芽胞桿菌、綠膿桿菌。霉菌包括: 黑曲霉、黃曲霉、變色曲霉、桔青霉、擬青霉、臘葉芽枝霉、球毛殼霉、綠色木霉
實驗前, 將各菌種接種于合適的培養(yǎng)基中, 于37℃ (細菌) 或28℃(霉菌) 下培養(yǎng)。細菌培養(yǎng)在2 天后, 霉菌培養(yǎng)在5 天后, 挑選適量菌落于滅菌的生理鹽水中, 制成一定濃度的混合細菌(1×108 個ömL ) 或混合霉菌懸液(1×107 個ömL ) , 置于4℃貯放備用。上海創(chuàng)賽科技提供7220-81-7，黃曲霉毒素B2(>98%,BR)，Aflatoxin B2，商品編號：C84-0627-1 mg，價格1482元。
?、谝淮渭泳?8 天微生物挑戰(zhàn)試驗
稱取各受試樣品30g,加入混合細菌或混合霉菌懸液, 每克受檢膏霜最終含菌量分別為5×106 個細菌和3×105 個霉菌。然后充分混勻, 置于28℃下。在接菌的0、7、14、21 和28 天取樣分析: 準確稱取3g 樣品, 加到含有玻璃小珠的滅菌錐形瓶內, 加入27mL 滅菌生理鹽水, 充分震蕩混勻, 此懸液為1∶10 稀釋液; 然后再用滅菌生理鹽水按10 倍依次稀釋。按平板傾注法計數(shù)受試品中含菌量, 細菌培養(yǎng)是37℃下24h～ 48h, 霉菌培養(yǎng)為28℃下3～ 5 天。此實驗用以評判防腐劑的有效與否。上海創(chuàng)賽科技提供94-13-3，尼泊金丙酯，GCS，商品編號：D16-1010228-5ml，價格98元。
評判標準為: 當每克樣品中一次接菌(1×106 細菌和1×105 霉菌) 后, 在第14 天存活菌量減少至不高于起始濃度的011% , 以后逐漸減少, 在28 天為0。符合標準為防腐劑有效(通過測試) , 不符合為防腐劑無效(不通過測試)。上海創(chuàng)賽科技提供MUG快速檢定大腸桿菌試劑，BR ，商品編號：D16-1024759-250g，詢價。
?、壑貜? 次加菌的微生物挑戰(zhàn)試驗
此方法參照國際CTFA (國際化妝品、香精和洗滌劑協(xié)會) 推薦的微生物挑戰(zhàn)性試驗。稱取受試樣品30g, 每隔2 周加菌一次(即實驗的第1、3 和5 周) , 每次加細菌量為1×106～ 1×107 個ög 樣品和霉菌1×105 個ö g～ 1×106 個ög 樣品。在加菌后的0 天、7 天和14 天(后一次加菌前) 采樣分析樣品中含菌量, 方法同前。此方法可將受檢樣品分為三類:
(1) 防腐效果優(yōu)良(W ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天時, 存活菌量減少至不高于起始濃度的0101% (即≤100 個ög 或mL 樣品, 通過測試)。
(2) 防腐效果尚可(M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天時, 存活菌量減少至不高于起始濃度的011% , (即≤1000 個ög 或mL 樣品, 通過測試)。
(3) 防腐效果差(P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天時, 存活菌量> 1000 個ög 或mL 樣品(不通過測試)。
二、結果
從結果看, 兩種加菌方法對防腐體系的評判結果基本一致, 三次加菌還可對有效的防腐體系作出程度之區(qū)別: 防腐優(yōu)良(W:W ell p reservat ive) 和防腐尚可(M :M arginal p reservat ive)。此外, 在一次加菌后1～ 2 周內能將樣品中含菌量降低至加入菌量的011% , 可通過3 次加菌實驗, 如防腐體系5 和8 對細菌的防腐力; 但若大于011% , 即使在以后的測試時間內有逐漸下降至0 的趨勢, 可能亦很難通過3 次加菌實驗,如防腐體系7 對細菌的防腐力。
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