分光光度法Spectrophotometry

　　基本原理

　　光線是高速運(yùn)動(dòng)的光子流，也是具有波長和頻率特征的電磁波。光子的能量與頻率成正比，與波長成反比。肉眼可見的光線稱為可見光?？梢姽庵徽茧姶挪ㄗV的很窄部分(400nm 到760nm)。不同波長的可見光具有不同的顏色。波長大于760nm 的光線稱為紅外線。波長小于400nm的光線稱為紫外線。

　　當(dāng)一束白光通過一杯有顏色的溶液時(shí)，具有一定波長的光線，選擇性的被溶液所吸收。不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對不同波長光線的吸收能力不同，因此每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。吸收光譜的測定可以用來鑒定各種不同的物質(zhì)。例如核黃素之所以呈現(xiàn)黃色，是由于它僅吸收可見光中的藍(lán)光范圍，并測得其吸收峰在450nm(圖2-1)。在紫外光范圍它還有兩個(gè)吸收峰。它們分別是260nm和370nm。

　　分光光度法常被用來測定溶液中存在的光吸收物質(zhì)的濃度。其理論依據(jù)是郎伯—比爾(Lambert-Beer)定律。

　　(一)郎伯定律(Lambert’s Law)

　　一束單色光在通過一溶液時(shí)，由于溶液吸收一部分光能，使光的強(qiáng)度減弱。若溶液的濃度不變，則溶液的厚度愈大，光強(qiáng)度的減弱也愈顯著(圖2-2)

　　若 I0表示入射光強(qiáng)度，I表示光線通過溶液后的強(qiáng)度，L 表示溶液的厚度。

　　(二)比爾定律(Beer’s Law)

　　當(dāng)一束單色光通過一溶液時(shí)，若溶液的厚度不變，則溶液濃度愈高，光線強(qiáng)度減弱也愈顯著，與上定律相似。兩者的關(guān)系可以表示如下：

　　其中，C表示溶液的濃度。K2是一常數(shù)，受光線波長、溶液性質(zhì)和溶液厚度的影響。上述公式所表示的光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系稱為比爾定律。雖然所有的溶液均符合郎伯定律，但并非所有的溶液都符合比爾定律。這是由于有些物質(zhì)在不同濃度條件下其顏色可能發(fā)生改變，即在不同濃度條件下其吸收光的波長發(fā)生改變。常見的原因如下：

　　1.有些有色物質(zhì)在溶液中可能解離成相應(yīng)的離子，離子的顏色與分子的顏色不同，造成對比爾定律的誤差。

　　2.有些物質(zhì)在較高濃度狀態(tài)下可形成絡(luò)合物，絡(luò)合物使吸收光譜發(fā)生改變。例如：氯化鈷在稀溶液中呈玫瑰色，而在濃溶液中呈藍(lán)色。

　　3.氫離子濃度和電解質(zhì)也可引起一些有色物質(zhì)顏色的改變，這些改變也可能造成比爾定律的誤差。

　　(三)郎伯——比爾定律及其應(yīng)用

　　一般將通過溶液后的光線強(qiáng)度(I)和入射光(Io)的比值稱為透光度(transmittance,T)，將-Log 用吸光度(absorbance, A)表示，以反映該溶液對光吸收的情況。有時(shí)也用吸光度(Optical density, O.D.)表示。則它們之間的關(guān)系如下

　　其中，E為消光系數(shù)(Extinction coefficient), 表示物質(zhì)對光線吸收的本領(lǐng)，其值因物質(zhì)種類和光線波長而異。

　　從公式(1)可知對于相同物質(zhì)和相同波長的單色光(消光系數(shù)不變)來說，溶液的吸光度和溶液的濃度呈正比。

　　如果C2為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，則可根據(jù)測得的吸光度值，按公式(2)求得待測溶液的濃度。

　　實(shí)際工作中為簡便起見，常常不是每測一個(gè)待測樣品都做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管，而是事先測定一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)管，然后以吸光度對標(biāo)準(zhǔn)濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得待測物質(zhì)的吸光度后，便可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到相應(yīng)的濃度數(shù)值。

　　從公式(1)可知，若知道某待測物質(zhì)的消光系數(shù)和溶液的厚度，也可以從吸光度推算出待測溶液的濃度。消光系數(shù)的常用表示方法有二：

　　1.百分消光系數(shù)(E1%1cm);濃度以百分濃度來表示的消光系數(shù)。百分消光系數(shù)等于濃度為1%，液層厚度為1cm 的吸光度值。

　　2.克分子消光系數(shù)(ε);濃度以摩爾濃度來表示的消光系數(shù)。克分子消光系數(shù)等于溶液濃度為1個(gè)摩爾濃度，液層厚度為1cm的吸光度值。

　　用消光系數(shù)計(jì)算濃度的公式是：

　　上海創(chuàng)賽科技性能卓越，白介素細(xì)胞因子，胎牛血清，電泳設(shè)備科學(xué)儀器，原料藥標(biāo)準(zhǔn)品，化學(xué)試劑，細(xì)胞培養(yǎng)耗材，上海創(chuàng)賽，海量產(chǎn)品特價(jià)促銷中，歡迎來電咨詢!