1.瓊脂糖電泳

　　(1)取一定量的待測(cè)DNA樣品，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切。DNA的量根據(jù)樣品的種類及

　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，?duì)于克隆片段的限制性內(nèi)切酶圖譜分析，取0.1-0.5μg即可;而對(duì)于鑒

　　定基因組DNA中的單拷貝基因序列，則需要10～20μg;當(dāng)采用寡核苷酸探針或探針的比放射

　　性活性較低時(shí)，則需要30～50μg。

　　(2)酶切完畢，在瓊脂糖凝膠中電泳。

　　(3)電泳結(jié)束后，EB染色，長(zhǎng)波紫外線下觀察電泳結(jié)果及照相。

　　2.印跡轉(zhuǎn)移

　　(1)切膠并作標(biāo)記(左下角切除)，以便于定位，然后將凝膠置于一容器中。

　　(2)將凝膠浸泡于適量的變性液中，室溫下放置1h 使之變性，不間斷地輕輕搖動(dòng)。

　　(3)將凝膠用去離子水漂洗1次，然后浸泡于適量的中和液中30 min，不間斷地輕輕搖動(dòng)。更換中和液，繼續(xù)浸泡15 min。

　　(4)將濾紙，NC膜剪成與膠同樣大小，NC膜浸入轉(zhuǎn)移buffer 中平衡30 min。

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　　(5)按圖操作：逐層鋪平，各層之間勿留有氣泡和皺折。

　　(6)虹吸轉(zhuǎn)移12-16h。

　　3.固定DNA

　　(1)取出轉(zhuǎn)移后的NC 膜，用濾紙吸干NC 膜，NC 膜光面朝上平鋪于變性液中變性5min。

　　(2)用相同的方法將NC膜平鋪在中性液上，中和兩遍，每遍5min。

　　(3)將膜夾在兩張干燥濾紙間，80℃烘烤1-2h。

　　4.預(yù)雜交

　　(1)將膜浸入5×SSC 中 2min，將膜放入干凈的塑料袋中。

　　(2)將預(yù)雜交液事先在65℃ 預(yù)熱，然后將10 ml 預(yù)雜交液加入袋中，封口。

　　(3)65℃預(yù)雜交1h 以上，不時(shí)搖動(dòng)。

　　5.雜交

　　(1)取出雜交袋，剪去一角去除雜交液后，加入5ml 雜交液及5μl 變性探針，排除氣泡后封口。

　　(2)將雜交袋放入65℃ 水浴中雜交過夜。

　　6.按下列條件洗膜

　　2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室溫5min /2 次

　　0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2 次

　　7.免疫酶聯(lián)檢測(cè)

　　(1)偶聯(lián)反應(yīng)

　?、儆弥泻鸵合茨?min，室溫。

　?、谟梅忾]液50ml 洗膜30min，室溫，輕搖。

　?、塾弥泻鸵簩⑾♂尶贵w-Dig –Ap 至 750 mU/ml ，將膜封入雜交袋，加入5 ml稀釋抗體輕搖50min。

　　④用中和液50 ml 洗膜，10min ×2 次，室溫，輕搖，除去未結(jié)合的抗體。

　　(2)顯色反應(yīng)①用平衡液20 ml平衡膜2min。

　?、趯⒛ぱb入雜交袋中，加入5ml 顯色液，避光30min 左右，當(dāng)出現(xiàn)顏色時(shí)不要晃動(dòng)。

　　③用TE洗膜終止反應(yīng)。

　?、?0℃烤干。

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