【基本原理】
利用DNA 連接酶把目的DNA 片段和載體DNA 連接在一起，成為一個新的重組分子。目的DNA片段被限制酶消化后其末端只可能有3種形式：
(1)帶有相同的粘性末端：用同一種酶或同尾酶處理可得這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同樣的酶消化，亦得兩個相同的粘性末端，因此在連接反應(yīng)中，外源目的基因片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化，而且正反兩種連接方向都有。為防止載體DNA 自身環(huán)化，在連接前需除去載體分子的5’-P，使之最大限度地抑制載體環(huán)化現(xiàn)象。
(2)帶有非互補(bǔ)的粘端：用兩種不同的限制酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生這樣的末端、一般情況下，常用質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)總能找到若干個不同的酶單酶切位點(diǎn);用兩種酶分別消化載體和目的DNA后，可將外源目的片段定向克隆到載體上。
(3)帶有平末端：由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA 聚合酶Klenow片段補(bǔ)平3’凹陷，使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠蕉恕３晒Φ倪B接反應(yīng)需純凈的目的DNA 片段和載體DNA 一般采用插入片段(目的DNA)與載體DNA 分子數(shù)比為3～5：1。目的基因比例太多，易產(chǎn)生基因自連后插入載體的多聚體。根據(jù)插入片段和載體的分子量大小計(jì)算連接反應(yīng)體系中需要加入的各DNA片段含量，計(jì)算公式如下：
【器材】
1.水浴箱
2.Eppendorf 管
3.離心機(jī)(上海創(chuàng)賽科技提供E23-TD5F臺式過濾離心機(jī)|離心機(jī)，商品編號：E23-TD5F-臺)
【試劑】
1.T4 DNA連接酶/10×T4 連接酶緩沖液
2.牛小腸堿性磷酸酶(CIP)/10×CIP緩沖液
3.0.5mol/L EDTA
【操作步驟】
1.建立下列去磷酸基團(tuán)的反應(yīng)體系：
10×CIP 緩沖液2μl
線性化載體(已酶切) 10μl
CIP 1μl
ddH2O 7μl
2.37℃水浴1h。
3.加入2μl 0.5mol/L EDTA, 65℃滅活15min。
4.經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，TE溶解DNA。
5.在Ep 管中建立連接反應(yīng)體系：
10×連接緩沖液 2μl
DNA片段(0.2μg) 2μl
線性化的載體DNA(0.1μg) 2μl
T4DNA連接酶1μl
ddH2O 13μl
6.混勻，16℃反應(yīng)數(shù)小時(shí)(5-12h)。
上海創(chuàng)賽科技性能卓越，白介素細(xì)胞因子，胎牛血清，電泳設(shè)備科學(xué)儀器，原料藥標(biāo)準(zhǔn)品，化學(xué)試
劑，細(xì)胞培養(yǎng)耗材，上海創(chuàng)賽，海量產(chǎn)品特價(jià)促銷中，歡迎來電咨詢!
