【基本原理】
核酸(DNA或RNA)分子探針是指能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，并可被特殊的方法探知的已知序列核酸片段。根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的性質(zhì)及探針的檢測(cè)方法不同，核酸探針可分為：放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。DNA 探針標(biāo)記的方法主要有：缺口平移法、隨機(jī)引物法、末端標(biāo)記法和化學(xué)標(biāo)記法等。本實(shí)驗(yàn)采用DIG DNA Labeling andDetection Kid(地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒)，通過(guò)隨機(jī)引物法標(biāo)記非放射性DNA探針。標(biāo)記原理是：以隨機(jī)六聚體作為引物(含有各種可能排列順序的六核苷酸混合物)，模板DNA變性后與引物一起退火雜交，在Ecoli DNA聚合酶Klenow片段的催化下，以單鏈DNA為模板，地高辛標(biāo)記的dUTP(Dig-11-dUTP )及其他四種dNTP為原料，以隨機(jī)六聚體為引物，合成與模板互補(bǔ)的DNA片段。由于在聚合反應(yīng)中Dig-11-dUTP 可摻入新合成的DNA 鏈，因此新生的DNA 互補(bǔ)鏈具有地高辛標(biāo)記，當(dāng)加入抗地高辛的堿性磷酸酶酶聯(lián)抗體后，探針與抗體形成抗體半抗原復(fù)合物，在底物(NBT和BCIP)存在下，經(jīng)堿性磷酸酶作用，在雜交部位形成藍(lán)色條帶或色斑。
【器材】
1.水浴箱
2.離心機(jī)(上海創(chuàng)賽科技提供E23-TD5F臺(tái)式過(guò)濾離心機(jī)|離心機(jī)，商品編號(hào)：E23-TD5F-臺(tái))
【試劑】
1. DIG標(biāo)記檢測(cè)試劑盒
2. 1×TE
3. 0.2mol/L EDTA(上海創(chuàng)賽科技提供60-00-4，乙二胺四乙酸(EDTA)，EDTA標(biāo)液，商品編號(hào)：16-1014183，價(jià)格288元)
4. 4mol/L LiCl
【操作步驟】
1.待標(biāo)記模板DNA 1μl (含DNA 20ng -200ng)
ddH2O 14μl
沸水浴加熱5 min ，冰浴迅速冷卻5min。
六聚體隨機(jī)引物2μl
dUTP混合物(含Dig-11-dUTP) 2μl
Klenow 酶 1μl
混勻,離心數(shù)秒，37℃水浴，4-20h 后，加入1μl 0.2mol/L EDTA 立即混勻，終止反應(yīng)。
2.再加入2.5μl 4mol/L LiCl 和75μl 無(wú)水乙醇(-20℃預(yù)冷)混勻， -20℃放置1-2h ，12 000rpm 離心10min，棄上清。
3.DNA沉淀干燥后，加入50μl TE 溶液溶解，-20℃ 保存。
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