【基本原理】

　　限制性內(nèi)切酶已有百余種，每種酶有其特定的核苷酸序列識(shí)別特異性，酶的活性需Mg+2來(lái)激活。不同的酶也有許多差別：有些酶除需Mg+2外，還需ATP 等其他輔助因子的激活;切割位點(diǎn)和識(shí)別序列間的距離不同;有的內(nèi)切酶同時(shí)具有甲基化作用。根據(jù)這些差別，可將限制性內(nèi)切酶分為I、II 和III 種類型。II 型限制性內(nèi)切酶只需要二價(jià)鎂離子的激活，酶在其識(shí)別序列內(nèi)切割雙鏈DNA，產(chǎn)生的各種DNA片段具有相同的末端結(jié)構(gòu)，而且大多數(shù)的II 型酶可提供粘性未端，有利于片段再連接，大部分II 型酶所識(shí)別的序列具有反向?qū)ΨQ的結(jié)構(gòu)，或稱之回文結(jié)構(gòu)。如EcoRI 和HindIII 的識(shí)別和切口分別為：

　　EcoRI ： G ↓AATT C HindIII ： A↓AGCT T

　　T TCGA↑ A C TTAA↑G

　　限制性內(nèi)切酶對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的酶切片段數(shù)與切口數(shù)一致。因此，鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷切口的數(shù)目;從片段遷移率可判斷酶切片段大小。用已知分子量的線狀DNA 為對(duì)照，通過(guò)電泳遷移率的比較，可以粗略地測(cè)出分子形狀相同的未知DNA的相對(duì)分子大小。

　　質(zhì)粒DNA的相對(duì)分子量(Mr )一般在106～107 范圍內(nèi)，如質(zhì)粒pBR322的相對(duì)分子質(zhì)量為2.8×106 ，在細(xì)胞內(nèi)有三種構(gòu)型：①共價(jià)閉環(huán)DNA，常以超螺旋形式存在;②如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開(kāi)環(huán)DNA;③雙鏈線狀DNA由于兩條鏈的切口在同一部位被切斷，不能成環(huán)，完全開(kāi)放成線狀，簡(jiǎn)稱線性DNA。如果要測(cè)定質(zhì)粒DNA的相對(duì)分子量，最好把質(zhì)粒用單一切口的酶水解得到線性DNA 片段。三種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA 在電泳時(shí)的泳動(dòng)速度為：共價(jià)閉環(huán)DNA>線狀DNA >開(kāi)環(huán)DNA。

　　本實(shí)驗(yàn)采用限制酶BamHI ，切割pUC18-KanR質(zhì)粒中插入的分子大小為1200 bp的KanR基因片段。

　　【器材】

　　1.水浴箱

　　2.高壓滅菌鍋

　　【試劑】

　　1.10×限制酶緩沖液

　　2.限制酶BamH I

　　3.DNA樣品，重組質(zhì)粒(見(jiàn)上)

　　【操作步驟】

　　1.在Ep管中分別加入以下試劑：

　　10×限制酶緩沖液2μl

　　pUC18-KanR 2μl

　　ddH2O 15μl

　　BamH I 1μl

　　2.將上液混勻，37℃保溫，1h。

　　3.加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)終止反應(yīng)。

　　4.1% 瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)酶切結(jié)果。

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