免疫組化(IHC)是病理診斷的主要輔助手段之一。雖然免疫組化在各個實驗室已經(jīng)常規(guī)開展，但是由于各個實驗室選擇的抗體試劑廠家、抗原修復方法、檢測系統(tǒng)等不同，免疫組化實驗技術操作方法亦不相同，染色結果會出現(xiàn)各種差異。免疫組化染色技術操作步驟看似簡單，但步驟較多且環(huán)環(huán)相扣，而且許多因素影響著免疫組化的結果，包括技術人員是否熟練掌握整個實驗的操作程序、抗體的特異性、檢測方法的敏感性、組織標本的固定、抗原的修復及修復液的PH值等眾多因素。所以，完成一張滿意的免疫組化切片并非那么簡單。20世紀末，非生物素型聚合物(Polymer)檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，可以有效地防止內(nèi)源性生物素的干擾，而且靈敏度高，操作便捷，已被免疫組化實驗室廣泛應用。當前，免疫組化技術標準化的討論是建立在由福爾馬林固定，石蠟包埋的組織切片并使用非生物素型聚合物檢測方法的基礎上而展開的。
1、免疫組化染色前的處理：組織的固定、取材、脫水、包埋、切片與展片、烤片、脫蠟
(1)組織的固定：固定的目的是防止組織、細胞自溶與腐敗，凝固或沉淀組織、細胞內(nèi)物質(zhì)，以保持組織和細胞固有形態(tài)和結構。對免疫組化而言更重要是保存組織、細胞內(nèi)的抗原，防止抗原破壞和彌散。需高度重視的是手術或穿刺離體組織必須馬上放于標本袋固定，固定后應與病理申請單及時送交病理科。病理醫(yī)生有責任與手術送檢科室進行必要的配合與溝通，避免手術后的病理標本隨意丟放。
由于免疫組化的固定劑種類較多，性能各異，不同抗原其穩(wěn)定性各不相同，因此，要了解不同固定劑的特征。常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。由于中性緩沖福爾馬林滲透力強、組織收縮小，能使大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，提高免疫組織化學檢測的陽性率，因此推薦作為病理標本的首選固定液。應避免使用含重金屬的固定劑。
10%中性緩沖福爾馬林配制方法：① 40%甲醛100ml;② 磷酸二氫鈉4g;③ 磷酸氫二鈉6.5g;④ 蒸餾水900ml。
固定液的量一般為組織塊總體積的5-10倍，小標本固定時間為4-6小時，大標本為18-24小時。固定時間不宜超過24小時，以防止組織經(jīng)甲醛過度固定造成的組織抗原損失和抗原活性降低。
(2)取材：組織標本的取材厚度一般為0.3cm(不應>0.5cm)，面積一般為(1.0-1.5)cm x (1.0-1.5)cm。
(3)脫水：組織在脫水機中的處理需十分恰當，大量的實驗室經(jīng)驗公認加熱抗原修復過程中組織脫片的主要原因是取材過厚以及脫水浸蠟處理不當所致。
(4)包埋與切片：組織經(jīng)過脫水、透明及浸蠟后，進行石蠟包埋。包埋的石蠟過熱或溫度過高容易導致組織抗原的破壞，尤其對于固定不佳的組織，需選用低熔點的石蠟(熔點<60°C)。
(5)切片與展片：切片也是免疫組化染色的重要環(huán)節(jié)，一般厚度在3-5um之間，淋巴結/淋巴組織和腎穿組織切片應該更薄些。切片要求完整，厚薄均勻，無皺褶無刀痕，太厚會影響免疫組化染色結果和判斷，還容易在染色過程中發(fā)生脫片。展片可采用二次展片，所謂二次展片：是指在展片過程中，先將組織切片漂浮在30%-40%的酒精溶液中，進行第一次展片，然后將切片撈起放入45-50°C的溫水中進行第二次展片。此方法的優(yōu)點是酒精溶液于水之間有一個張力差，這樣處理可得到平整無皺褶的組織切片，但像脂肪之類細胞間粘附性較小的組織接觸酒精后會散開，不建議采用此法。
(6)烤片：推薦58-60°C恒溫箱烤片2-3小時，但不能進行高溫烤片，因為在干燥的條件下加熱切片可以加速組織內(nèi)抗原的氧化而破壞組織中的抗原，使抗原定位不明確。
(7)暫不染色切片的保存：進行免疫組化染色最好采用新切片。在實際工作中，蠟塊面端可以采用蠟封來避免抗原損失以便長期保存。如果切好暫不染色的切片，應該將切片放置于4°C冰箱短時間保存。
(8)脫蠟：免疫組化的脫蠟過程與常規(guī)HE脫蠟步驟相同。
2、免疫組化抗體的選擇、稀釋和保存
(1)選擇：選擇抗體應先了解其反應譜和適用條件(包括適用切片<石蠟切片或冰凍切片>、稀釋度及溫育時間等)。使用一種新抗體時，必須首先摸索出最佳滴度，所謂最佳滴度就是能獲得最佳特異反應所需抗原的最低濃度。或者按照有關說明書的提示。
(2)稀釋：① 一般用0.01M PBS，PH值7.2;② 或用0.05M TBS，PH值7.6;③ 必要時可按需要加適量小牛血清清蛋白。
(3)保存：合理地保存使用抗體十分重要，這樣才能最大限度地發(fā)揮抗體的作用，使抗體不致在短期內(nèi)失去活性。①濃縮型抗體：應先根據(jù)廠家提供的效價，將其分類?？砂?ul、10ul、20ul等至100ul為一單位分裝入安瓿或0.25ml帶蓋塑料離心管中，并注明標記(批號、名稱、效價、量)，密封后放入-20°C —-40°C低溫冰箱中保存，用時按需用量取出，稀釋后置4°C冰箱保存使用，切勿反復凍存，以免效價降低;②即用型抗體可置于4°C冰箱中保存。遠程運送，路途攜帶，郵寄抗體時，應加冰、干冰、防濕材料，以免影響效價。
3、免疫組化中被測組織的抗原修復
(1)組織細胞經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定后，其切片中的抗原決定簇因醛的交聯(lián)作用而被封閉，抗原結構的理化性質(zhì)發(fā)生顯著的改變，表位空間結構改變而導致許多抗原免疫活性丟失，影響了抗原的定位。目前在免疫組化實驗中，抗原修復是影響染色結果的最關鍵因素之一。
常用的抗原修復方法是加熱抗原修復法和酶消化法。有些抗體不需要進行抗原修復，有些抗體需要酶消化法，有些抗原需要加熱修復法，有些抗體則需要幾種抗原修復技術的聯(lián)合應用(抗原雙重修復法)，至于哪種抗體是否需要抗原修復以及如何修復，一般試劑公司在產(chǎn)品目錄或說明書上會予以說明。
(2)酶消化法：現(xiàn)免疫組化實驗室中主要是胰酶消化法和胃酶消化法。① 胰蛋白酶消化法：濃度一般是0.05-0.1%，37°C下溫育15-30分鐘;② 胃蛋白酶消化法：濃度一般為0.04%，37°C下溫育10-30分鐘。
(3)加熱抗原修復法：主要包括：高壓法、微波法、水浴法。
英聯(lián)邦免疫細胞化學室間質(zhì)控組織(UK NEQAS-ICC)進行過一項由105家實驗室參與，歷時兩年(1996年8月-1998年8月)的研究對ER、PR進行8次循環(huán)反饋實驗，進行不同實驗室間實驗方法的比較的結論，就目前實驗室間ER、PR染色結果偏弱的原因最終得出一致性實驗結論，即由于微波加熱時間不足與實驗室中操作控制不當所致，故強烈推薦使用高壓抗原修復方法。
抗原修復必須使用耐高溫塑料切片架，不能使用銅染色架，以防止因修復液PH值改變抗原修復效果，修復結束后必須等修復液冷卻至室溫后，才能取出切片，取出后的切片需要用自來水充分洗滌，修復液的量必須保證所有切片都能浸泡到，無論哪一步驟都不能使切片干燥。用過的檸檬酸修復液或EDTA修復液不建議反復使用。影響抗原修復的基本因素是加熱的溫度和時間以及加熱處理時浸泡切片的抗原修復液的PH。
(4)抗原修復液的選擇：加熱抗原修復液有多種，如檸檬酸修復液(PH6.0)、EDTA修復液(PH8.0-9.0)、EGTA(PH9.0)、Tris修復液(PH10.0)，至于需要哪種修復液，應該根據(jù)試劑公司提供的產(chǎn)品目錄或說明書上的預處理方法。
4、防脫玻片的制備
由于免疫組化過程長，組織切片長時間浸泡在緩沖液和試劑內(nèi)經(jīng)過多次沖洗浸泡和作用，尤其是在抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等因素的影響，極易造成脫片，因此，必須在載玻片上涂上粘附劑，增加切片的粘附作用。一般采用多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)和APES兩種粘附劑。
?、?多聚賴氨酸防脫玻片的制備：多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)1份;蒸餾水9份。
配制方法：取多聚賴氨酸1份，蒸餾水9份，置于干凈的玻璃容器中，混合均勻，將充分洗凈、預先干燥的玻片浸泡入稀釋好的多聚賴氨酸中5-10秒，取出放置于室溫下晾干或60°C干燥箱內(nèi)烘干備用。處理后的玻片避光干燥可長期保存、備用。濃縮多聚賴氨酸液室溫(18-26°C)貯存，有效期12個月。稀釋后的工作液2°C-8°C冰箱保存，有效期3個月。
?、?APES玻片的制備：APES1份;丙酮50份。
配制方法：取APES1份，丙酮50份，置于干凈的玻璃容器中，充分攪拌均勻。將洗凈的玻片放入稀釋好的APES液中20-30秒后取出，稍停，在放入純丙酮液洗去多余的APES液，置通風櫥中晾干即可。注意，用APES防脫玻片處理玻片撈片時組織應一步到位，不要留有氣泡。濃縮液室溫(18-26°C)貯存，有效期12個月。
Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用且效果最好的一種防脫片劑，多聚賴氨酸溶液也可按1：10稀釋成工作液，適合于需要酶消化、微波、高壓的防脫片處理。
5、免疫組化染色
(1)內(nèi)源性過氧化物酶的阻斷：在一些細胞中存在過氧化物酶和過氧化氫酶等，它們能使H202分解，DAB沉積而著色，最常見的是紅細胞(血紅蛋白)，另外還有橫紋肌細胞(肌球蛋白)、粒細胞和單核細胞(細胞色素)、肝細胞和腎細胞(過氧化氫酶)，如果不進行處理，組織中紅細胞、粒細胞等會干擾染色結果的判斷，消除內(nèi)源性過氧化物酶干擾的辦法就是將組織切片浸泡在3%的H2O2中10分鐘。
(2)內(nèi)源性生物素的阻斷：抗原修復對組織中內(nèi)源性生物素受到不同程度的封閉，在加熱抗原修復增強抗原表位暴露的同時，也增強了組織中內(nèi)源性生物素的呈現(xiàn)。內(nèi)源性生物素指的是組織內(nèi)能夠與抗生素蛋白結合的分子或基團，使用生物素-鏈霉菌抗生素蛋白的結合形成足以以假亂真的陽性。
周小鴿等人2002年采用組織芯片技術對大范圍的正常組織和腫瘤組織進行的系統(tǒng)性研究顯示：① 冰凍組織中存在生物素;② 經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋后的組織中生物素被封閉;③ 加熱抗原修復可造成生物素暴露;④ 生物素暴露的強度各不相同，強者可到強陽性(+++);⑤ 生物素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中;⑥ 生物素在組織中的分布形式，特別是腺上皮組織，包括正常組織和腫瘤組織，亦存在部分非上皮組織;⑦ 生物素暴露的強弱與修復液亦有關，PH9.0EGTA的暴露能力比PH8.0EDTA和PH6.0的檸檬酸更強;⑧ 加熱抗原修復暴露的生物素可以被蛋清液封閉。
周小鴿等人提出建議：凡采用加熱抗原修復和生物素相關檢測系統(tǒng)，應進行生物素常規(guī)封閉，冰凍切片做免疫組化染色時亦應進行生物素常規(guī)封閉，或者采用非生物素檢測系統(tǒng)，如Envision等，堅持使用陰性對照。
在實驗室中一般凡進行加熱抗原修復處理并準備使用生物素-抗生素辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)，免疫組化染色的組織都需要進行內(nèi)源性生物素封閉處理。阻斷內(nèi)源性生物素的方法是采用卵白素-生物素(Avidin-biotin)加以封閉，在常溫下孵育20-30分鐘即可，Avidin-biotin可以與組織中內(nèi)源性生物素結合，以消除影響。但最簡便的方法是使用非生物素的酶聚合物檢測系統(tǒng)。
(3)血清封閉：作為檢測試劑的抗原蛋白帶有一定的負電荷，免疫組化染色時，易與帶正電荷的組織(特別是纖維組織、變性和<或>壞死的細胞、嗜酸性粒細胞等)發(fā)生靜電吸引而導致非特異性染色(實驗室使用的封閉血清，一般在加一抗之前使用，選擇的血清種屬一般與二抗的種屬相同)，去除這種非特異性染色最有效的方法是，在滴加一抗前，先滴加用于制備第二抗體動物的非免疫血清或滴加除制備第一抗體動物以外的其他動物非免疫血清，濃度為1：5—1：20，正常血清保護作用時間10-20分鐘。
(4)沖洗緩沖液：實驗室中常用沖洗緩沖液為PBS和TBS(PH7.2-7.4)。沖洗緩沖液中加入0.025%Tween-20可以增強緩沖液的效果。
(5)一抗孵育：① 即用型第一抗體可按照廠家提供的實驗操作條件進行實驗(邁新實驗室針對即用型抗體穩(wěn)定性與長期有效保存條件的問題進行了長達1年時間對照追蹤實驗觀察，結果表明：即用型抗體在4°C冷藏條件下存放14個月是穩(wěn)定的);② 濃縮型抗體一般按照廠家提供的建議稀釋度進行成倍稀釋預實驗，以選擇最佳稀釋度。抗體的最佳稀釋度是指：在無背景染色的情況下，獲得最佳強度陽性信號的抗體稀釋度。一般染色背景深大多是抗體濃度過濃所致;③ 抗體孵育時的溫度一般以25°C±8°C為準，在此區(qū)間內(nèi)，一抗的孵育時間為30-60分鐘。
若溫度較低應適當延長孵育時間，反之要適當減少孵育時間，或者在4°C冰箱過夜，冰箱4°C下孵育常需要注意的是：抗體孵育應在潮濕密封閉的環(huán)境中進行，避免抗體水分蒸發(fā)造成抗體的濃縮或干燥，致使染色背景產(chǎn)生。高質(zhì)量的孵育盒是免疫組化的必要實驗用品。免疫組化染色過程的試劑濃度，孵育時間是相關聯(lián)的，濃度與溫度和時間基本呈反比，即濃度過高孵育，溫度應越低，孵育時間應該越短，反之亦然，因此，每個實驗室應根據(jù)各自的情況，合理處理三者的關系，摸索出一套適合自己的工作條件。
(6)常用檢測系統(tǒng)：目前常用的檢測系統(tǒng)為辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)，主要為兩類：① 以生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白鏈接的辣根過氧化物酶(Biotin-Streptavidin-HRP)檢測系統(tǒng)，如：SP、ABC、SABC等;② 以聚合物(Polymer)鏈接的辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)，如：MaxVision、Elivision、EnVision等。這兩類檢測系統(tǒng)都是在國內(nèi)外臨床廣泛采用的檢測方法。非生物素型酶聚合物檢測系統(tǒng)敏感性較高、操作便捷、無內(nèi)源性生物素干擾，已成為免疫組化的常規(guī)檢測系統(tǒng)。
(7)顯色系統(tǒng)：由于通常采用的是辣根過氧化物酶，因此選擇DAB(棕色)或AEC(紅色)作為酶底物顯色。若采用的是堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)則選擇BCLP/NBT(藍紫色)作為酶底物顯色。
?、貲AB陽性部位呈棕色，一般以蘇木素復染。配制DAB時應注意：a、DAB具有致癌性，可誘發(fā)皮膚癌和膀胱癌，使用過程中勿將試劑沾到皮膚、眼睛或衣服上，若發(fā)生此情況應立即用大量的水沖洗，用過的DAB應倒入清潔液中集中消毒處理;b、DAB一定要新鮮配制，如有沉淀可過濾后使用，否則未溶的DAB顆粒會沉積在切片上，影響結果的觀察，配制好的的溶液避光保存，30分鐘內(nèi)有效;c、DAB的濃度不宜太高，否則會增加背景染色。H2O2濃度也不宜太高，否則會加速反應，也可增加背景染色。室溫下染色約為3-5分鐘，可在顯微鏡下觀察控制染色時間。DAB試劑盒冰箱4-8°C避光保存。
②AEC陽性部位呈紅色，如以蘇木素或亮綠等作為背景染色，則效果更好，配制AEC時應注意：a、配制AEC過程中勿將試劑沾到皮膚、眼睛或衣服上，若發(fā)生此情況應立即用大量的水沖洗;b、由于終產(chǎn)物溶于乙醇中，不能用酒精處理，因陽性棕紅色產(chǎn)物能溶于究酒精中，故需甘油明膠封片，不能長期保存;c、若出現(xiàn)沉淀可過濾后使用，配制好的溶液避光存放，30分鐘內(nèi)有效，染色結果為紅色，室溫下染色約為8-20分鐘，可在顯微鏡下觀察控制染色時間。AEC試劑盒冰箱4-8°C避光保存。顯色時間不宜過長，過長可導致背景著色，但也不宜過短，過短可導致假陰性染色。
(8)復染、脫水、透明、封固
免疫組化復染一般只需蘇木素淺淡的染色(1-3分鐘)，蘇木素的配方不同，但首選的是Harris蘇木素襯染。在經(jīng)0.1%鹽酸酒精分化，自來水藍化，常規(guī)脫水透明后封片。
6、標準化實驗對照的設立
免疫組化對照實驗的設立在免疫組織化標準化中是極其必要的，正確設立陽性、陰性對照，才能確保免疫組化染色過程的準確性、抗體及相關試劑有效性，是對技術人員實驗操作和試劑供應商提供試劑質(zhì)量的驗證，也是對患者的負責。對照的設立包括試劑對照和組織對照，分別作為陽性和陰性對照。
(1)試劑對照：主要是為了確定所使用的一抗和檢測試劑盒的特異性，替代對照是使用與一抗相同種屬來源非免疫血清或其他免疫球蛋白代替一抗，或使用PBS代替一抗進行染色。
Vimentin抗體可以作為免疫組化染色中一種很有用的陽性對照試劑，在每次免疫組化染色中加入Vimentin染色作為陽性對照，可以觀察甲醛固定后抗原表達的敏感性，對甲醛固定后抗原損傷的程度進行分析。
(2)組織對照：組織對照實驗有陽性對照、陰性對照和組織內(nèi)部對照。
① 陽性對照：對照組織中含有已知的抗原，常用的陽性對照有多組織蠟塊、組織芯片等;② 陰性對照：用確定不含有待測抗原的組織作為陰性對照組織;③ 組織內(nèi)部對照：待測組織自身含有某種相關抗原，如淋巴結內(nèi)一定含有血管內(nèi)皮細胞，在觀察外部陽性和陰性的同時，也要注意到內(nèi)部的表達情況，有時候可以起到相當關鍵的作用。當然，有不少染色或病例缺乏內(nèi)陽性對照，若對染色反應有疑問，只能選用另外的陽性對照片核實，若內(nèi)(或外)陽性對照是組織免疫反應陰性，瘤組織陽性則表達假陽性;瘤組織陰性則表明假陰性，只有陽性對照染色陽性，瘤組織反應才屬真實，除了觀察內(nèi)陽性對照外，還要看內(nèi)陽性對照是否有非特異性反應。
7、免疫組化染色結果正確判讀
實驗室染色結果的觀察、染色結果的判定需要豐富的經(jīng)驗，免疫組化染色最終是否能得到正確的結論，關鍵還要看對染色結果如何評價，在判斷免疫組化染色結果時，為確保其準確性，必須要注意：① 首先應觀察常規(guī)石蠟切片，形成初步診斷意見，在觀察免疫組化染色結果時，應以有意義的組織/細胞為準，即主要觀察有意義的組織/細胞的反應是陽性反應還是陰性反應;② 免疫組化染色結果必須建立在組織陽性對照和陰性對照實驗有效的基礎上，這是正確判斷染色結果的前提。只有當陽性對照呈陽性反應，陰性對照呈陰性反應，且背景清晰時才能從正反兩面說明抗體的稀釋度和效價準確、染色方法和步驟準確無誤、無交叉反應及非特異性染色;③ 染色陽性結果應在預期的組織/細胞結構上定位清晰準確。陽性表達有強弱之分，只要在抗原的特定部位上，即使有少數(shù)細胞有抗原表達，也應視為陽性表達;④ 陰性結果是組織細胞內(nèi)預期區(qū)域中未見抗原表達;⑤ 免疫組化染色結果為病理診斷輔助信息，當免疫組化染色結果與HE診斷不相符或發(fā)生矛盾時，應以HE診斷為標準，而不能簡單的用免疫組化染色結果推翻、否定HE診斷，應在多做抗體標記并結合臨床資料及實驗室影像學檢查等全面綜合分析再做出正確診斷。
染色陽性的判斷：特別要注意內(nèi)源性生物素造成的非特異性染色(如在肝、腎及富含線粒體的細胞等)，常常表現(xiàn)為非特異的胞漿陽性?？傊?，只有陽性對照染成陽性，陰性對照基本陰性，這樣的免疫組化染色結果才可信。
一般來講，免疫組化染色陽性結果比陰性結果更有意義，因為陰性結果可能緣于許多因素，可能抗原的確不存在，或抗原含量低，組織處理時抗原丟失，染色方法不敏感或操作有誤。在免疫組化鑒別診斷過程中，大多數(shù)染色結果的判讀為陽性或陰性即可，但在某些特殊情況下，如腫瘤組織中激素受體含量、分子靶向治療藥效，細胞增殖指數(shù)等進行免疫組化檢測時，染色結果可用半定量計數(shù)法。
染色強度：(-)陰性、(±)弱陽性、(++)中度陽性、(+++)高度陽性;陽性細胞分布：(-)陰性、(+)少數(shù)細胞陽性、(++)中等細胞陽性、(+++)多數(shù)細胞陽性。
8、免疫組化報告
免疫組化實驗報告已經(jīng)融合在病理常規(guī)報告中，除了在本醫(yī)院病理科與手術送檢科室之間進行程序化的規(guī)范使用外，隨著各個病理科實驗室間的交流日益廣泛，標準化的免疫組化報告已成為必不可少的交流資料。免疫組化實驗報告中包括如下內(nèi)容：
(1)病人的一般資料介紹;
(2)免疫組化檢測系統(tǒng);
(3)注明所選擇抗體的品名、克隆號、細胞定位及表達意義;
(4)實驗對照的設立;
(5)醫(yī)生對免疫組化結果的詮釋。
最大限度、正確地敘述待測組織中抗原表達信息是病理免疫組化報告的基本要求。在條件允許下，病理免疫組化報告單應附有免疫組化染色圖片。
參考書目
[1]吳秉銓，劉彥仿主編。免疫組織化學病理診斷。北京：北京科學技術出版社，2007.
[2]王學民，田乃增主編。免疫組織化學和分子生物學實用技術。北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.
[3]中華醫(yī)學會編著。臨床技術操作規(guī)程病理學分冊。北京：人民衛(wèi)生出版社，2004.
作者：徐開軍(云南省第三人民醫(yī) 院病理科)
