Part 1：產(chǎn)品選擇
?。何乙I Human EGF 用于體外細(xì)胞培養(yǎng)，網(wǎng)上一查，好多種相似產(chǎn)品，我該如何選擇？
?。褐亟M蛋白選擇，有幾個重點選擇標(biāo)準(zhǔn)，我給你們列出來了！
圖 1. 重組蛋白表達步驟
選擇因素 1：研究目的
在選擇產(chǎn)品前，明確實驗?zāi)康?，可排除一些干擾因素。
圖 2. 重組蛋白表達體系的選擇和對比
選擇因素 2：產(chǎn)品特性
活性數(shù)據(jù) (Biological Activity)
ED50半數(shù)有效量 (Median effective dose, ED50) 在量反應(yīng)中指能引起 50% 最大反應(yīng)強度的藥量，在質(zhì)反應(yīng)中指引起 50% 實驗對象出現(xiàn)陽性反應(yīng)時的藥量。一般是通過其在標(biāo)準(zhǔn)化條件下對特定細(xì)胞類型的影響 (例如刺激細(xì)胞增殖) 來測量的。
小貼士：如何將 ED50轉(zhuǎn)換為比活力單位？
: 如下圖中，通過Human EGF 劑量依賴性刺激小鼠 BALB/c 3T3細(xì)胞增殖，ED50<0.2 ng/mL。
一個活性單位是每毫升具有最大響應(yīng)作用 50% 的細(xì)胞因子的數(shù)量：
Human EGF 1 個 unit (1U) 就是 0.2 ng/mL，每 1 mg 的 Human EGF 的活力值 (unit) 為:
即 Human EGF 的比活力為 5.0 × 106units/mg。
計算當(dāng)然也是有捷徑的：
進入公眾號 “MCE 抑制劑”-重組蛋白復(fù)溶計算器-比活力計算器
Part 2：老生常談—重組蛋白復(fù)溶及保存
：由于工藝原因，蛋白凍干粉產(chǎn)品會呈現(xiàn)粉末狀或肉眼不易觀察到的透明薄膜狀、膠凍狀、雪花狀，這些都是正?，F(xiàn)象。凍干的體積大小也會受凍干前緩沖液組分、鹽離子濃度、產(chǎn)品濃度等影響。此外，在運輸過程中，凍干顆?？赡軙稚ⅲ⒄掣接谄勘诤推可w。
MCE 保證每管產(chǎn)品的蛋白總量達到標(biāo)示含量。說到這里，講講怎么更好地溶解重組蛋白吧~
第一步：開蓋前需離心
在開蓋使用之前，需先離心，將凍干粉收集于管底。實驗操作: 10,000-12,000 rpm 離心 30 s，若沒有高速離心機，3000-3500 rpm，離心 5 mins。
第二步：產(chǎn)品復(fù)溶
還是以 Human EGF 為案例；10 μg 規(guī)格溶解
敲黑板：無論長期實驗還是短期實驗，溶解的濃度不低于 100 μg/mL??！
短期實驗：使用復(fù)溶 Buffer 直接溶解的重組蛋白，液體可在 2-8℃ 最長保存 1 周。對于周期較短的實驗 (不超過 7 天)，可以直接取該條件下保存的細(xì)胞因子或者重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可，一周之內(nèi)用完。
(復(fù)溶 Buffer: 可參考重組蛋白使用指南里建議的溶液或者使用已貼心搭配好的蛋白伴侶）
長期實驗：以下步驟供參考：
1. 先加 20-30 μL 建議復(fù)溶液
2. 再加 70-80μL 含載體蛋白 (0.1% BSA, 5% HAS, 10% FBS, 或 5% 海藻糖) 的緩沖液/培養(yǎng)基
3. 分裝大于 20 μL/管
第三步：產(chǎn)品保存
用復(fù)溶 Buffer 重懸的蛋白溶液用含載體蛋白 (0.1% BSA, 5% HAS, 10% FBS, 5% 海藻糖) 的溶液稀釋后，-20℃ 可保存至少三個月。
Part 3：產(chǎn)品細(xì)節(jié)篇
：以下一些小細(xì)節(jié)也要注意。
1. 溶解過程中不要采用渦旋震蕩輔助溶解
上期給大家說到：化合物的溶解可以借助水浴、超聲、渦旋、震蕩等方法助溶。但對于重組蛋白來說，具備一定的空間結(jié)構(gòu)會使其活性更佳。
正確操作：移液器槍頭輕輕吹打混勻或者上下顛倒混勻。若無法做到充分溶解，可以將復(fù)溶產(chǎn)品至于水平搖床低速搖一段時間或 4℃ 靜置 2 h 以上。
2. 稀釋用的含載體蛋白的溶液選擇
特別注意的是，稀釋用的含載體蛋白的溶液是指有一定緩沖能力、pH 值為中性的溶液，如 PBS、培養(yǎng)液 DMEM 或者 RPMI1640 等。不可直接用水來代替。
3. 不同重組蛋白之間是否可以交叉使用？
重組蛋白的種屬交叉活性需要根據(jù)具體產(chǎn)品而定；建議盡量選擇對應(yīng)種屬。如實在無法匹配種屬：
a . 大多數(shù)人細(xì)胞因子對小鼠細(xì)胞有效 (僅少數(shù)例外)。
b. 干擾素，GM-CSF，IL-3，IL-4 具有種屬特異性，例如重組人的這些細(xì)胞因子只能作用于人細(xì)胞，對小鼠和大鼠等其他種屬無效果。
c. 成纖維細(xì)胞生長因子 (FGFs)、神經(jīng)營養(yǎng)素 (Neurotrophins，如 BDNGF/GDNF/CNTF/β-NGF 等)、TGF-β 等高度保守，各種屬間交叉活性強。
d. 同源交叉性的比對：打開蛋白數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站 Uniport，進行數(shù)據(jù)比對。
以上信息僅供參考，畢竟文獻是最好的老師。
4. 有些蛋白帶了標(biāo)簽，有什么作用？
重組蛋白的融合標(biāo)簽是在目的蛋白 N 端或 C 端進行融合表達的特定蛋白、多肽或寡肽標(biāo)簽。常用的標(biāo)簽有 His、GST、MBP、Trx、TF、MBP、Nus、SUMO、Flag 和 Fc 等。
