Di 屬于長鏈二烷基碳菁類染料，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具有極強(qiáng)親脂性，可與脂溶性生物結(jié)構(gòu)結(jié)合，在一定濃度下，可以對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行完全染色。Di 染料被激發(fā)后具有很高的淬滅系數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命，在細(xì)胞與組織定位示蹤中起到了極大作用。

常見 Di 染料

　　常見的 Di 染料包括 DiO、DiI、DiD、DiR，在被激發(fā)后形成不同顏色的熒光 (如圖 1)。

圖 1. DiO、DiI、DiD、DiR 光譜圖

　　■ DiO 染色為例，簡(jiǎn)要拋出體外實(shí)驗(yàn)步驟

　　a）接種適量數(shù)目的細(xì)胞，37°C 培養(yǎng)過夜。

　　b）去除培養(yǎng)基，離心收集細(xì)胞，加入 PBS 洗滌 2-3 次，每次 5 分鐘。

　　c）加入對(duì)應(yīng)濃度 DiO 工作液 (5-10 μM)，室溫孵育 30 分鐘。

　　d）400 g，4℃ 離心 3-4 分鐘，棄去上清。再次加入 PBS 洗滌細(xì)胞 2-3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DiO。

　　f）用無血清培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞后，在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下檢測(cè)。

圖 2. 實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)圖

　　好了，接下來上實(shí)例！

　　■ DiO

　　DiO 為綠色熒光染料，激發(fā)/發(fā)射波長為 483/501 nM，DiO 常被用于正向或逆向示蹤各類細(xì)胞或組織。(但相較其他三種染料，DiO 染料熒光強(qiáng)度較弱，對(duì)于某些固定的組織切片染色效果略差)。

　　Xin Li 等人研究了 CPCs (心臟祖細(xì)胞) 衍生的外泌體 (CPCs-Ex) 是否可以利用 mTOR 信號(hào)通路來減少病毒性心肌炎的細(xì)胞凋亡。研究人員用 DiO 對(duì) CPCs-Ex 進(jìn)行標(biāo)記(Dio 可通過選擇性分割被納入細(xì)胞膜)，評(píng)估 H9C2 細(xì)胞對(duì) CPCs-Ex 的體外攝取，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) H9C2 細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞質(zhì)均包含熒光信號(hào) (圖 2)，并減少 H9C2 細(xì)胞的凋亡，確定了 CPCs-Ex 在 CVB3 感染細(xì)胞中的抗凋亡作用。

圖 3. H9C2 細(xì)胞攝取 DiO 標(biāo)記的外泌體^[1]

　　■ DiI

　　DiI 為橙紅色熒光染料，激發(fā)/發(fā)射波長為 551/569 nM，DiI 被用于正向或逆向示蹤各類細(xì)胞或組織，熒光信號(hào)強(qiáng)度高于 DiO，在進(jìn)入細(xì)胞膜時(shí)，其熒光信號(hào)會(huì)被大幅度放大。

　　如圖 4 所示，Dil 染料標(biāo)記外泌體，然后與目標(biāo)細(xì)胞共培養(yǎng)。使用共聚焦顯微鏡捕捉 HOS 細(xì)胞對(duì) Dil 標(biāo)記外泌體的攝取，其中被標(biāo)記的外泌體發(fā)出特異性橙紅色熒光。

圖 4. HOS 和 MG63 細(xì)胞攝取紅色熒光染料 Dil 標(biāo)記的 hBMSC-Exos^[2]

Dil 染料購自 MCE

　　■ DiD

　　DiD 為一種紅色熒光染料，激發(fā)/發(fā)射波長為 646/663 nM，DiD 熒光信號(hào)高、不易淬滅、自身熒光干擾低，不僅用于細(xì)胞/組織染色，小動(dòng)物活體成像中是很常用的。

　　Yuxuan Fu 等人研究出一種藥物傳輸方法來達(dá)到抗新冠藥物更好的進(jìn)入靶器官的目的，研究者使用 DiD 標(biāo)記細(xì)胞外小泡 (EV) 病毒蛋白的受體結(jié)合域 (EV-RBD) ，并進(jìn)行小鼠尾靜脈注射，通過熒光成像可以看到，信號(hào)主要在心臟、肺、腎臟中聚集，并且值得注意的是，在 96 h 時(shí)，標(biāo)記的 EV-RBD 累積的熒光信號(hào)仍保留在肺組織中，這證明了該方法的可行性。

圖 5. DiD 標(biāo)記 EV-RBD 在小鼠體內(nèi)分布情況亡^[3]

DiD 染料購自 MCE

　　■ DiR

　　DiR 是一種近紅外染料，激發(fā)/發(fā)射波長為 754/778 nm，用于正向或逆向示蹤各類細(xì)胞或組織，與 DiD 一樣，DiR 自身熒光背景較低，也被用在活體成像中。

　　今天的介紹暫時(shí)就到這里了，小伙伴們看完是否有小小收獲？

　　■ 產(chǎn)品匯總

　　MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

　　參考文獻(xiàn)

　　1. Lei Zhong, Yueshan Li, Shengyong Yang, et al. Small molecules in targeted cancer therapy: advances, challenges, and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2021 May 31;6(1):201.

　　2. Xin Li , et al. Exosomes derived from carDiac progenitor cells attenuate CVB3-induced apoptosis via abrogating the proliferation of CVB3 and modulating the mTOR signaling pathways.Cell Death Dis. 2019 Sep 18;10(10):691.

　　3. Yao Huang , et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells promote osteosarcoma development by activating oncogenic autophagy. J Bone Oncol