P21 活化蛋白激酶（p21-activated protein kinase, PAK）作為一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是 Rho 家族中的小 GTP 酶 CDC42 及 Rac1的效應(yīng)蛋白，介導其下游信號通路的轉(zhuǎn)導。 PAK4 是 PAKs 中的一員，當 PAK4 表達異常時，細胞發(fā)生癌變。Wang C 等研究表明^[1]，PAK4 在肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌細胞中的表達含量遠遠高于正常細胞，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和遷移產(chǎn)生重要影響。因此，PAK4 抑制劑的開發(fā)是多種腫瘤治療行之有效的策略之一。

　　Hao C 等^[2], 基于藥物的結(jié)構(gòu)，設(shè)計并合成了一系列氨基喹唑啉類 PAK4 抑制劑，同時對該系列化合物進行選擇性和藥代動力學性質(zhì)優(yōu)化，獲得了一個高活性高選擇性的 PAK4 抑制劑 31（CZh226）。它對 PAK4 的 Ki 值為 9 nM，對多種激酶表現(xiàn)出優(yōu)秀的選擇性，其中對 PAK1 的 Ki 值為 3112 nM，選擇性差異達到了 346 倍。多種優(yōu)秀的藥效和藥代動力學參數(shù)使得化合物 31被選做先導化合物，進一步進行抗癌藥物的開發(fā)。（圖1）

圖1. 化合物 31的結(jié)構(gòu)式（圖片來源：《J. Med. Chem.》）

　　研究者隨后探究了 PAK4 與化合物 31的作用模式，共晶復合物結(jié)構(gòu)顯示，化合物 31 的氨基吡唑與 Glu396 和 Leu398 形成氫鍵并相互作用，環(huán)丙基與 Met395 和Val335 形成了很強的疏水相互作用，哌嗪環(huán)上的 NH 與 Asp458 的羧基形成氫鍵作用，Asp444 的羧基通過誘導分子的構(gòu)象變化進而與哌嗪環(huán)上的 NH 形成靜電作用。而化合物 31與 PKA1 的預測結(jié)合模式顯示，氨基酸殘基 Asp407 側(cè)鏈發(fā)生位移，從而難以與哌嗪環(huán)上的 NH 形成靜電作用。此外，化合物 31與 PKA4 對接打分優(yōu)于其與 PKA1 的對接打分，這些結(jié)果與體外選擇性實驗結(jié)果一致。（圖2）

圖2. （A，C）PAK4 與化合物 31 的共晶結(jié)構(gòu)（PDB：5XVG）；

（B，D）PAK1與化合物31的預測結(jié)合模式（圖片來源：《J. Med. Chem.》）

　　激酶譜實驗顯示，化合物 31在 0.1 μM 和 1.0 μM 濃度下對多種激酶具有很好的選擇性。其中，在 0.1 μM 的篩選濃度下對 PAK4 產(chǎn)生超過80%的抑制（PAK4 IC₅₀=0.0111 μM），這可能是由于化合物 31與 PKA4 蛋白的 DFG 模塊在空間上可以更好的結(jié)合。（圖3）

圖3. 化合物 31在 0.1 μM 和1.0 μM 下對 54 個激酶的選擇性（圖片來源：《J. Med. Chem.》

　　通過細胞實驗進一步評價化合物 31 對 PAK4 的抑制作用。首先采用非小細胞肺癌細胞株 A549 來評價化合物的抗增殖作用。其次，采用 HEK-293 細胞（人類胚胎腎 293 細胞）和生長不依賴于 PAK4 的 NCI-H460 細胞株（人類大細胞肺癌細胞）來評價化合物的潛在脫靶效應(yīng)。結(jié)果顯示，化合物 31 對 A549 細胞（圖 4A）具有中度的抗增殖活性，這一相對較低的細胞生長抑制活性結(jié)果表明，PAK4 可能不是這些癌細胞增殖的“驅(qū)動力”。隨后使用劃痕法和 Transwell 法評估化合物 31 對腫瘤細胞遷移和侵襲的影響，未給藥的 A549 細胞在劃痕后的 2天內(nèi)，大部分的劃痕部位都被填滿了，而給予一定劑量的化合物 31 后則顯著抑制了傷口愈合（圖 4B）。這一結(jié)果表明化合物 31可顯著抑制 A549 細胞遷移和侵襲（圖 4C）。與此相反，NCI-H460 和 HEK-293 細胞遷移和侵襲的減少并不明顯，這表明化合物 31 對細胞活性的抑制是通過抑制 PAK4 而產(chǎn)生的。（圖 4）

圖4. 化合物 31 通過抑制 PAK4 激酶活性調(diào)節(jié)下游信號通路來抑制 A549 的遷移和入侵

（圖片來源：《J. Med. Chem.》）

　　小M 的小思考：

　　PAK4 作為一種有潛力的藥物開發(fā)靶點，其抑制劑的開發(fā)為治療相關(guān)的癌癥提供了新思路。截至目前，PAK4 的抑制劑數(shù)量很少，且多數(shù)抑制劑的活性不理想。目前已經(jīng)進入臨床階段的小分子抑制劑有 KPT-9274 和 PF-3758309，其具有良好的 PAK4 抑制效果和藥代動力學性質(zhì)。本文發(fā)現(xiàn)了一個新型、有效高選擇性的 PAK4 抑制劑 31（CZh226），它通過抑制 PAK4 激酶活性，調(diào)節(jié) PAK4 的下游信號通路，抑制了A549 腫瘤細胞的遷移和入侵，是一個有潛力的先導化合物，可用于進一步抗癌藥物的開發(fā)。

　　Reference：

　　[1] Wang C, et al. Oncogenic PAK4 regulatesSmad2/3 axis involving gastric tumorigenesis.Oncogene.2014 Jun 26;33(26):3473-84.

　　[2] Hao C,et al. Structure-Based Design of 6-Chloro-4-aminoquinazoline-2-carboxamideDerivatives as Potent and Selective p21-Activated Kinase 4 (PAK4) Inhibitors. J.Med. Chem., 2018, 61 (1), 265–285.

　　相關(guān)產(chǎn)品：

　　KPT-9274

　　KPT-9274 是有口服活性的 PAK4 /煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 (Nampt) 抑制劑，IC₅₀值分別為小于 100 和 125 nM。

　　FRAX1036

　　FRAX1036 是一種 PAK抑制劑，對 PAK1，PAK2 和 PAK4 的 Ki 值分別為 23.3 nM，72.4 nM 和 2.4 μM。

　　PF-3758309

　　PF-3758309 是一種有效的 PAK 抑制劑，能夠抑制 PAK4 的活性，IC₅₀值為1.3 nM。

　　熱門產(chǎn)品線：

　　天然產(chǎn)物：

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　　抑制劑：

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