氨氧化古菌（AOA）作為硝化細(xì)菌的一類，是海洋中最豐富的微生物之一。它們通過氧化氨獲取能量，在此過程中意外產(chǎn)生強(qiáng)效溫室氣體氧化亞氮（N?O）。目前關(guān)于AOA氮代謝的酶學(xué)細(xì)節(jié)仍缺乏系統(tǒng)研究。
近期，美國(guó)康奈爾大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在PNAS上發(fā)表了題為“Nitrous oxide production via enzymatic nitroxyl from the nitrifying archaeon Nitrosopumilus maritimus”的研究論文，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的酶（Nmar_1354），該酶通過將專性硝化中間產(chǎn)物羥胺（NH2OH）的氧化與氧氣（O?）還原耦合，選擇性生成亞硝基（HNO）。盡管該化合物會(huì)經(jīng)歷多個(gè)下游反應(yīng)，但其主要去向是通過與羥胺反應(yīng)生成氮?dú)猓∟?），以及自身二聚化形成N?O。這些發(fā)現(xiàn)為AOA釋放N?O提供了合理的酶學(xué)機(jī)制解釋。
傳統(tǒng)認(rèn)知中，細(xì)菌通過血紅素酶（HAO）途徑產(chǎn)N?O。但基因組分析顯示，氨氧化古菌完全缺乏這類關(guān)鍵基因。更奇怪的是，它們體內(nèi)攜帶大量多銅氧化酶（MCOs），暗示著一條全新的代謝路徑。
研究團(tuán)隊(duì)鎖定了一種特殊酶——Nmar_1354。這種來(lái)自海洋古菌Nitrosopumilus maritimus的多銅氧化酶，結(jié)構(gòu)獨(dú)特，帶有罕見的"懸掛式"銅結(jié)合域。為驗(yàn)證其功能，研究團(tuán)隊(duì)使用英國(guó)Hansatech的Clark液相氧電極測(cè)定系統(tǒng)（Oxygraph+）。該儀器能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶液中溶解氧的變化，分辨率可以達(dá)到10-3pmol/ml，成為破解細(xì)胞呼吸、線粒體呼吸和酶活性的關(guān)鍵“偵測(cè)器”。
圖1 Nmar_1354晶體結(jié)構(gòu)
研究人員重組表達(dá)并純化了Nmar_1354，并通過多種光譜手段確認(rèn)了其銅中心的正確組裝。核心問題是：它能催化什么反應(yīng)？與N?O產(chǎn)生有關(guān)嗎？
圖2 Nmar_1354催化NH?OH氧化產(chǎn)生HNO、N?O和N?
圖S7 使用6μM Nmar_1354和[NH2OH]0= 20 mM的代表性呼吸測(cè)量曲線。
在有氧條件下，Oxygraph+的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nmar_1354能有效催化消耗O?，反應(yīng)速率隨NH?OH濃度增加而逐漸飽和（圖2A，S7）。動(dòng)力學(xué)模型分析得出：Vmax = 0.83 ± 0.1μM?1s?1，Km = 22 ± 5 mMNH?OH，Kcat = 0.3 ± 0.1 s?1，Kcat/KM = 13.6 ± 0.5 M?1s?1。實(shí)時(shí)質(zhì)譜（DEMS）顯示，當(dāng)加入1?N標(biāo)記的NH?OH時(shí)，O?消耗伴隨著產(chǎn)物1?N1?N和1?N1?NO（即1?N?和1?N?O）的同步生成（圖2D）。O?耗盡，反應(yīng)停止，證明O?是必需的電子受體。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)證實(shí)Nmar_1354催化反應(yīng)的主要?dú)怏w產(chǎn)物之一是N?O（圖2B紅點(diǎn)）。其產(chǎn)量隨初始NH?OH濃度增加，但非化學(xué)計(jì)量（即不是每消耗一份NH?OH就產(chǎn)生固定量的N?O）。
圖S8 使用5μM硫酸銅和[NH2OH]0 = 10 mM的代表性呼吸測(cè)量曲線。
使用游離Cu2?（CuSO?）也能催化NH?OH產(chǎn)生N?O（Fig. S8），但此反應(yīng)可被EDTA完全抑制。而Nmar_1354的催化活性不受EDTA影響，證明是酶本身的活性，而非污染物金屬離子。另一種MCO（大腸桿菌CuEO）對(duì)NH?OH無(wú)活性（Fig. S9），說(shuō)明此功能并非所有MCO共有。
圖S9 使用10μM CuEO和30 mM羥胺的代表性呼吸測(cè)定曲線
該反應(yīng)是否產(chǎn)生了假說(shuō)中的中間體——亞硝基（HNO）？HNO極不穩(wěn)定，易二聚成N?O或與NH?OH反應(yīng)生成N?。研究人員使用了一種熒光探針P-CM。該探針能特異性與HNO反應(yīng)，發(fā)出強(qiáng)烈熒光。在包含Nmar_1354和NH?OH的反應(yīng)體系中加入P-CM后，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)了3.6倍（圖2C）。這提供了強(qiáng)有力的間接證據(jù)，表明反應(yīng)中確實(shí)產(chǎn)生了HNO！
反應(yīng)方程式：
2NH?OH + O? → 2HNO + 2H?O
Nmar_1354催化此反應(yīng)，將NH?OH選擇性氧化為HNO，同時(shí)還原O?。產(chǎn)生的HNO極不穩(wěn)定，會(huì)迅速發(fā)生多種反應(yīng)：
二聚化：2HNO → N?O + H?O；主要產(chǎn)生N?O。
與NH?OH反應(yīng)：HNO + NH?OH → N? + 2H?O；主要產(chǎn)生N?（圖2D中檢測(cè)到的1?N1?N來(lái)源）。
與O?反應(yīng)：HNO + O? → ONOO?；最終分解為硝酸鹽（NO??）。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到約40 μM NO??生成，與模型預(yù)測(cè)一致。
本研究是微生物氮循環(huán)和金屬酶學(xué)領(lǐng)域的重要突破。它不僅闡明了海洋溫室氣體N?O的一個(gè)重要生物來(lái)源，揭示了古菌獨(dú)特的代謝策略，還首次在酶學(xué)水平上捕捉到了神秘分子HNO的生成。理解這些微觀過程的細(xì)節(jié)，對(duì)于精準(zhǔn)構(gòu)建全球氮循環(huán)和溫室氣體排放模型，最終應(yīng)對(duì)氣候變化挑戰(zhàn)，具有深遠(yuǎn)的意義。
