一、實驗器材及試劑
1、實驗器材
名稱廠家型號
脫水機武漢俊杰電子有限公司 JJ-12J
包埋機武漢俊杰電子有限公司JB-P5
病理切片機上海徠卡儀器有限公司RM2016
凍臺武漢俊杰電子有限公司JB-L5
組織攤片機浙江省金華市科迪儀器設備有限公司KD-P
烤箱上?；厶﹥x器制造有限公司DHG-9140A
載玻片江蘇世泰實驗器材有限公司80312-3181
蓋玻片江蘇世泰實驗器材有限公司10212432C
微波爐格蘭仕微波爐電器有限公司P70D20TL-P4
脫色搖床谷歌生物TSY-B
渦旋混合器谷歌生物MX-F
掌上離心機谷歌生物D1008E
移液槍DragonKE0003087/KA0056573
組化筆Gene techGT1001
正置熒光顯微鏡日本尼康Nikon Eclipse C1
成像系統(tǒng)日本尼康Nikon DS-U3
2、主要實驗試劑
試劑廠家貨號稀釋比
無水乙醇國藥集團化學試劑有限公司
二甲苯國藥集團化學試劑有限公司
EDTA（PH8.0)抗原修復液谷歌生物G1206
EDTA(PH9.0)抗原修復液谷歌生物G1203
檸檬酸（PH6.0)抗原修復液谷歌生物G1202
PBS緩沖液谷歌生物G0002
自發(fā)熒光淬滅劑谷歌生物
BSA谷歌生物G5001
一抗
熒光二抗
DAPI谷歌生物G1012
抗熒光淬滅封片劑谷歌生物G1401
二、石蠟切片免疫熒光實驗步驟
1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。
2、抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中火8min?；?min轉中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據(jù)組織來確定）
3、畫圈自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。
4、血清封閉:在圈內滴加BSA孵育30min。
5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）
6、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。
7、DAPI復染細胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。
8、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
9、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光
三、石蠟切片免疫熒光結果判讀
DAPI染出來的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光或者綠光
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