修飾肽純化的一般目標(biāo)和方法
首先，自然來(lái)源或者重組表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)過一些粗提的步驟(例如：勻漿、離心、硫酸銨沉淀等)成為穩(wěn)定的可以用于色譜分離的樣品。
然后進(jìn)行捕獲色譜(capture chromatography)，主要目標(biāo)是濃縮和去除大量的容易去除的雜質(zhì)，此步最關(guān)心的是流速和載量，常采用高載量、快流速凝膠。
經(jīng)過濃縮的部分純化的樣品進(jìn)行中級(jí)色譜(intermediate chromatography)，目的是去除較難去除的雜質(zhì)，此步最關(guān)心的是分辨率，常采用高分辨率的細(xì)顆粒凝膠。
最后為了得到符合要求的最終產(chǎn)品，去除殘存的雜質(zhì)以及目的蛋白的多聚物或者降解片斷，進(jìn)行精制色譜(polishing chromatography)，常采用具有高分辨率的凝膠過濾凝膠進(jìn)行凝膠過濾色譜。
2、修飾肽純化前的準(zhǔn)備工作
(1)樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)
a、測(cè)定樣品在pH 2-9的穩(wěn)定性;
b、測(cè)定樣品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸銨中的穩(wěn)定性;
c、測(cè)定樣品在0-50%乙醇、甲醇中的穩(wěn)定性;
d、測(cè)定樣品在4-40℃的穩(wěn)定性;
e、室溫下靜置過夜，測(cè)定對(duì)蛋白水解酶的穩(wěn)定性。
(2)樣品預(yù)處理
a、去除樣品中顆粒物(0.45-0.22微米膜過濾或者10000 g離心15分鐘)
b、去除樣品中脂類( 10000 g離心15分鐘或有機(jī)溶劑抽提)
c、去除樣品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)
d、抑制樣品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制劑、低溫下快速第一步分離或在蛋白酶缺陷宿主中表達(dá)重組蛋白)
(3)樣品的保存條件：
短期儲(chǔ)存(小于24小時(shí))
a、避免接近或超過樣品的穩(wěn)定極限防止蛋白質(zhì)變性或沉淀
b、在密閉容器中冰箱冷藏
較長(zhǎng)期儲(chǔ)存(數(shù)天)
a、b、同上
c、加入適當(dāng)?shù)囊志鷦?
長(zhǎng)期儲(chǔ)存
a、同上
b、冰凍或者最好凍干(真空冷凍干燥)保存。
3、對(duì)每一純化步驟的評(píng)價(jià)相關(guān)方法的建立a、目的蛋白含量測(cè)定
酶活性測(cè)定、生物活性測(cè)定、放射免疫、酶聯(lián)免疫、免疫電泳、熒光。
b、總蛋白含量測(cè)定
紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料結(jié)合法(考馬斯亮蘭G-250)等。
c、樣品復(fù)雜度檢測(cè)
HPLC(離子交換、凝膠過濾、反相)、SDS-PAGE、等電聚焦、毛細(xì)管電泳(CE)。
4、蛋白質(zhì)的來(lái)源
(1)天然蛋白： 天然產(chǎn)物中的目的蛋白一般含量很少而且組分極復(fù)雜，在分離過程中須采用多步驟才能去除各種雜質(zhì)，并應(yīng)在整個(gè)過程中降低蛋白水解酶的活性。
(2)重組蛋白： 重組蛋白則目標(biāo)蛋白的豐度較高。重組蛋白主要有三種表達(dá)定位：
a、細(xì)胞質(zhì)：在種情況下，必須破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)才能得到目的蛋白質(zhì)，同時(shí)伴隨著大量核酸和其它上千種宿主蛋白質(zhì)的釋放;在表達(dá)量較高的條件下，一般形成包涵體，包涵體含有過表達(dá)目的蛋白，且容易通過高速離心分離，但是包涵體的溶解與復(fù)性是較復(fù)雜的。
b、外周質(zhì)： 表達(dá)的蛋白質(zhì)存在于細(xì)菌內(nèi)膜與外膜之間，這樣目的蛋白可以較少地受到蛋白酶的作用并減少了宿主蛋白的污染。
c、分泌到培養(yǎng)基：這種表達(dá)一般蛋白質(zhì)濃度較低，主要受到培養(yǎng)基中的污染。
