CCK8全稱(chēng)Cell Counting Kit-8試劑，可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8[化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。該試劑主要用途有：藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)
WST-8屬于MTT的升級(jí)產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物(formazan)。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450mM波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。上海創(chuàng)賽提：供WST-8水溶性四氮唑-8，193149-74-5，商品編號(hào)：CLS-42493-100mg，價(jià)格930元
CCK法應(yīng)用非常廣泛，如藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)以及生物因子的活性檢測(cè)等。
CCK法的操作步驟
實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞活性檢測(cè)
1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100μL/孔)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)(37℃,5% CO2)。
2、向每孔加入10 μL CCK溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))。
3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。
4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。
5、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)
1、在96孔板中配置100μL的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(37℃，5% CO2)。
2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。
3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如：6、12、24或48小時(shí))。
4、向每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))。
5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。
6、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。
7、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基(除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基)，去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。上海創(chuàng)賽提供供：65162-13-2，1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯鹽[用于生化研究]，商品編號(hào)：C12-M1442-200MG，價(jià)格1974元
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