傳代培養(yǎng)是指需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿(瓶)內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)的過程。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。

　　傳代培養(yǎng)中的細(xì)胞傳代培養(yǎng)(subculture)，當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止;另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。

　　[實(shí)驗步驟]

　　準(zhǔn)備工作：

　　1)肥皂洗手，在進(jìn)行無菌操作前，用75% 的酒精擦拭雙手，注意指間，和指甲周圍。同時，用酒精棉球擦拭超凈臺。上海創(chuàng)賽科技提供95%藥用酒精，Alcohol(95%)，藥用級，64-17-5，商品編號：C16-A11087-500ml，價格25元。

　　2)將培養(yǎng)液放置室溫，備用。

　　3)打開超凈臺內(nèi)的紫外燈，照射20 min。同時，將實(shí)驗所需材料也放入超凈臺進(jìn)行滅菌(血清、培養(yǎng)基除外)上海創(chuàng)賽科技提供Gibco RPMI 1640培養(yǎng)基，商品編號：C11875500BT-500ml，價格68元。

　　4)倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞的狀態(tài)，是否已經(jīng)長滿培養(yǎng)瓶，需要進(jìn)行分瓶。

　　實(shí)施工作：

　　1)關(guān)閉超凈臺的紫外燈，打開風(fēng)機(jī)。

　　2)點(diǎn)燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待用。

　　3)在打開培養(yǎng)瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶蓋，打開后，瓶口在酒精燈上過火焰，再用吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，注意，吸管不要碰到布滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶的側(cè)壁。上海創(chuàng)賽科技提供250ml一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶(標(biāo)準(zhǔn)型)表面處理，商品編號：C81-TCF011025-12.5cm²，濾膜蓋200只/箱，價格672元。

　　4)將胰酶加入培養(yǎng)瓶內(nèi),顯微鏡下隨時觀察，見到細(xì)胞的突起消失，變圓時，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出胰酶。記住不要消化時間過長，否則，細(xì)胞會被胰酶消化掉。上海創(chuàng)賽科技提供胰酶，Pancreatin，USP級，8049-47-6，商品編號：C16-P10849-50g，價格85元。

　　5)加入適量Hanks液或培養(yǎng)基清洗一遍，立即倒掉。

　　6)加入含有10%血清的培養(yǎng)基，用吹打管吹打，一定要輕輕吹打，使其從瓶壁上脫落分散到培養(yǎng)基中，再補(bǔ)加培養(yǎng)基，按1:3進(jìn)行分瓶。然后，用火焰燒培養(yǎng)瓶的瓶口和蓋，再蓋好培養(yǎng)瓶的蓋，放到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

　　以上介紹的是貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，對于懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，只需要將細(xì)胞進(jìn)行離心，1000 rpm，5 min,然后，換入新的培養(yǎng)基即可。再分裝到不同的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

　　不健康的細(xì)胞質(zhì)中有空泡，細(xì)胞內(nèi)有顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞間空隙增大，變形，不規(guī)則，失去原有的特點(diǎn)。

　　實(shí)驗注意：

　　傳代或換液24~ 48 h注意觀察細(xì)胞是否被污染，污染的細(xì)胞培養(yǎng)液變渾濁，鏡下可見有大量菌絲。如果細(xì)胞生長緩慢，生長特性改變，胞質(zhì)內(nèi)顆粒性物質(zhì)增多，盡管培養(yǎng)液不變渾濁，考慮可能有支原體污染。污染的細(xì)胞立即從培養(yǎng)箱中取走，以免污染其它細(xì)胞。

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