經(jīng)驗(yàn)結(jié)論

　　1、如果PCR產(chǎn)物很短，200bp以內(nèi)，那么用SYBR做Q-PCR沒(méi)有問(wèn)題的話，可以用。

　　2、如果PCR產(chǎn)物比較長(zhǎng)，那最好重新設(shè)計(jì)引物。

　　3、如果用TaqMan做Q-PCR，那很可能需要重新設(shè)計(jì)引物。這個(gè)一般產(chǎn)物都在100bp左右，太大了酶的外切效率太差。上海創(chuàng)賽科技提供0.5ml單管PCR管，平蓋，無(wú)DNA，RNA酶，商品編號(hào)：C81-PCR000500-1000只/包，價(jià)格248元。

　　4、如果RT-PCR引物的效率不好，SYBR會(huì)降低一點(diǎn)PCR效率，那會(huì)導(dǎo)致PCR無(wú)法擴(kuò)增。也只能重新設(shè)計(jì)引物。上海創(chuàng)賽科技提供163795-75-3，SYBR Green1，熒光染料，BR ，商品編號(hào)：D23-RS1151-100微升，價(jià)格416元。

　　原因

　　1. 產(chǎn)物越短，相對(duì)而言，PCR效率越高。

　　而qPCR如果要Relative Quantification的話，使用ddCT方法的假設(shè)是100%PCR的效率。因此產(chǎn)物越長(zhǎng)越偏離這個(gè)假設(shè)。定量越不準(zhǔn)確。特別是當(dāng)跟內(nèi)參做比較，而內(nèi)參的擴(kuò)增效率不同。這樣就產(chǎn)生兩條不同的回歸線。而這兩條線由于效率不同而相交。導(dǎo)致在交點(diǎn)上下的時(shí)候定量相對(duì)關(guān)系發(fā)生改變，引起明顯的定量誤差。這個(gè)還是要小心的。即使絕對(duì)定量，PCR效率越高，反應(yīng)就越敏感，曲線的動(dòng)態(tài)范圍更大。也就是說(shuō)可以定量的范圍更廣。因此一般不超過(guò)200bp。當(dāng)然也確實(shí)有人做比較大的產(chǎn)物，但是一般不會(huì)這么推薦。

　　2. qPCR的目的是獲得熒光數(shù)據(jù)，而不是獲得PCR產(chǎn)物。

　　所以一般都以盡快完成PCR周期為目標(biāo)。自然要盡量縮短每個(gè)周期的時(shí)間。如果產(chǎn)物太長(zhǎng)自然要更多的延長(zhǎng)時(shí)間。對(duì)qPCR來(lái)說(shuō)實(shí)在沒(méi)有必要。

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