一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
學(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖電泳法鑒定DNA的原理和方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理
瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下（pH8.0的緩沖液）帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中通過(guò)凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng)，不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率液不同。溴化乙錠（EB）可嵌入DNA分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶，達(dá)到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。上海創(chuàng)賽科技提供1239-45-8，溴化乙錠(EB)，BR 進(jìn)分99%,商品編號(hào)：D16-1013683-1g，價(jià)格518元。
三、實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)14提取的DNA樣品，
四、器具及藥品
電泳儀，電泳槽，紫外透射反射儀，恒溫水浴鍋，微波爐，微量進(jìn)樣器，三羥甲基氨基甲烷，鹽酸，醋酸鈉，EDTA，瓊脂糖，溴酚藍(lán)，溴化乙錠。上海創(chuàng)賽科技提供77-86-1,三羥甲基氨基甲烷,Tris>99%,分子生物學(xué)級(jí) ，商品編號(hào)：C84-3739-100g，價(jià)格65元。
五、實(shí)驗(yàn)步驟
1、安裝電泳槽
將有機(jī)玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開(kāi)口封好，放在水平的工作臺(tái)上，插上樣品梳。
2、瓊脂糖凝膠的制備
稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，（按0.3-1.5%的瓊脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝膠，20-100kb的DNA用0.5%的凝膠，200-2000bp的DNA用1.5%的凝膠）置微波爐或沸水浴中加熱至完全溶化（不要加熱至沸騰），取出搖勻。上海創(chuàng)賽科技提供9012-36-6,瓊脂糖 ITM，Agarose ITM，Gel Strength(1.5% gel)>1,200 g/cm2 ,商品編號(hào)：C84-2678-5G，價(jià)格93元。
3、灌膠
將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。
4、待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，然后拔出梳子。
5、加樣
將DNA樣品與加樣緩沖液按4：1混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加10-20μl，記錄樣品的點(diǎn)樣次序和加樣量。
6、電泳
安裝好電極導(dǎo)線，點(diǎn)樣孔一端接負(fù)極，另一端接正極，打開(kāi)電源，調(diào)電壓至3-5V/cm，電泳1-3hr，當(dāng)溴酚藍(lán)移到距凝膠前沿1-2cm時(shí)，停止電泳。上海創(chuàng)賽科技提供JY-JX5快速SSR電泳槽，電泳儀，商品編號(hào)：C71-JY-JX5-臺(tái)，價(jià)格1176元。
7、染色和觀察
取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為DNA條帶，或在紫外燈下照相記錄電泳圖譜。溴化乙錠是致癌劑，操作時(shí)要小心，必須戴手套。上海創(chuàng)賽科技提供UV-Ⅱ手提紫外燈，紫外分析儀，商品編號(hào)：C71-UV-Ⅱ-臺(tái)，價(jià)格1050元。
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