對亍SYBR? Green染料法，最好在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，加一個(gè)熔解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性。

　　評估qPCR反應(yīng)的效果，一般從擴(kuò)增效率、精確度以及靈敏度三個(gè)方面進(jìn)行。

　　評估擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)以及5個(gè)數(shù)量級倍數(shù)(5 logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。同時(shí)，PCR擴(kuò)增效率也是決定反應(yīng)靈敏度的關(guān)鍵因素。

　　標(biāo)準(zhǔn)偏差是最常用的精確度計(jì)量方法。許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就小;如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。實(shí)際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會形成大致的正態(tài)分布。

　　如果PCR反應(yīng)效率是100%，那么2倍稀釋點(diǎn)之間的平均Ct值間隔應(yīng)該恰為1個(gè)Ct值。要以99.7%的幾率分辯2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于0.167。標(biāo)準(zhǔn)偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情冴下分辨出2倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等亍0.250。

　　對于靈敏度，無論CT絕對值是多少，仸何能夠有效擴(kuò)增和梱測起始模板拷貝數(shù)為1的系統(tǒng)都達(dá)到了靈敏度的極限。為了更可靠地梱測低拷貝，必須做大量的平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)來提供統(tǒng)計(jì)顯著性，幵兊服泊松分布的限制。