AtomTraceLIBS元素分析技術(shù)
——應(yīng)用于植物金屬元素分布快速Mapping
AtomTrace是歐洲工程技術(shù)中心（CEITEC）的唯一衍生公司，公司成員均為布爾諾大學(xué)激光光譜與化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室的科研人員。實(shí)驗(yàn)室起始于1997年，在LIBS應(yīng)用技術(shù)研發(fā)領(lǐng)域具有近20年的深厚經(jīng)驗(yàn)，其研制生產(chǎn)的Sci-Trace LIBS元素分析系統(tǒng)獲得捷克國(guó)家2016年年度最佳合作獎(jiǎng)冠軍。而在此之前，AtomTrace團(tuán)隊(duì)曾在歐洲LIBS元素分析大賽中斬獲第一名的優(yōu)異成績(jī)！
使用Sci-Trace，便意味著得到了全球頂尖的專(zhuān)業(yè)團(tuán)隊(duì)技術(shù)支持和實(shí)驗(yàn)室合作。
不同的營(yíng)養(yǎng)及礦物質(zhì)含量，極大的影響植物的生長(zhǎng)和代謝對(duì)于環(huán)境的響應(yīng)。元素測(cè)量一直采用ICP-OES或者AAS的傳統(tǒng)方法，缺點(diǎn)是樣品預(yù)處理復(fù)雜，容易引入新的雜質(zhì)并造成測(cè)量誤差。但最關(guān)鍵的是，無(wú)法得到元素分布的空間信息。而如若分布模式不同，即使含量相近，對(duì)植物生理狀態(tài)的影響也差異巨大。而LIBS技術(shù)可以在植物活體狀態(tài)下無(wú)須預(yù)處理進(jìn)行元素mapping掃描快速分析，恰恰彌補(bǔ)了這一缺憾。LA-ICP-MS技術(shù)同也可進(jìn)行元素分布掃描，但仍存很多問(wèn)題有待克服：激光燒蝕樣品經(jīng)載氣運(yùn)送至ICP，會(huì)在運(yùn)送管中有顆粒物殘留； ICP中大顆粒氣化不完全；記憶效應(yīng)（前次測(cè)量對(duì)下次測(cè)量結(jié)果的影響）；霧化室及運(yùn)送管中的死角對(duì)信號(hào)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的影響；必須在同一位置多次測(cè)量才能獲得足夠強(qiáng)的信號(hào)等等。因此對(duì)于植物中元素分布的測(cè)量，LIBS被認(rèn)為是最優(yōu)也是最有前景的測(cè)量技術(shù)。
?AtomTrace研究團(tuán)隊(duì)很早就關(guān)注到LIBS技術(shù)在植物科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。2006年，JozefKaiser博士（AtomTraceCEO、布爾諾科技大學(xué)光譜技術(shù)實(shí)驗(yàn)室主任）等即在EuropeanPhysicalJournal上發(fā)表了“Femtosecond laser spectrochemical analysis of plant samples”，應(yīng)用libs技術(shù)對(duì)山茱萸整個(gè)葉片中的Fe、Mn元素進(jìn)行分布mapping研究。當(dāng)時(shí)在該實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)e的LOD（檢測(cè)限）已經(jīng)做到5ppm。
AtomTrace團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用LIBS技術(shù)在植物元素分析領(lǐng)域一直在孜孜不倦的探索，優(yōu)化算法、開(kāi)發(fā)軟件、優(yōu)化儀器-----例如用真空反應(yīng)室、雙激發(fā)技術(shù)等提高mapping分辨率，開(kāi)發(fā)AtomAnalyzer光譜數(shù)據(jù)分析軟件將計(jì)算速度提高10倍，研制紫外真空模塊檢測(cè)0-300nm紫外光區(qū)域譜線等。測(cè)試對(duì)象既有活體植物，也有干枯樣品；包括植物根、莖、葉等植物各部分組織；植物種類(lèi)包括旱生植物，也包括高水分含量的水生植物；定性定量測(cè)量的元素涉及對(duì)植物有重要影響的Al、Ca、C、Mg、P、Si、Sr、Zn、B、Cu、Fe、Mn、Pb、K、S、Na、Cl、H、N、Ni、Ba、Ag等等。并發(fā)表植物L(fēng)IBS分析領(lǐng)域高影響因子文章如下：
1. Pavlína M, Karel N, Pavel P, Jakub K, P?emysl L, Helena Z. G, Kaiser J, Comparative investigation of toxicity and bioaccumulation of Cd-based quantum dots and Cd salt in freshwater plant Lemna minor L.[J],Ecotoxicology and Environmental Safety, 147 (2018) 334–341.
2. Krajcarová L, Novotný K, Kummerová M, J. Dubová J, Gloser V, Kaiser J. Mapping of the spatial distribution of silver nanoparticles in root tissues of Viciafaba bylaser-inducedbreakdownspectroscopy(LIBS) [J], Talanta173 (2017) 28–35.
3. Lucie K, Novotny K, Petr B, Ivo P, Petra K, Vojtech A, Madhavi Z. Rene K, Kaiser J, Copper Transport and Accumulation in Spruce Stems Revealed by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy, [J]. Electrochemical Science, 8 (2013) 4485 – 4504.
4. Zitka O, Krystofova O, Hynek D, et al. Metal Transporters in Plants [M]. Heavy Metal Stress in Plants. 2013: 19-41.
5. Kaiser J, Novotny K, Martin M Z, et al. Trace elemental analysis by laser-induced breakdown spectroscopy—Biological applications [J]. Surface Science Reports, 2012, 67 (11–12): 233-243.
6. Michaela G, Jozef K, Karel N, et al. Utilization of laser-assisted analytical methods for monitoring of lead and nutrition elements distribution in fresh and dried Capsicum annuum I. leaves [J]. Microscopy Research and Technique, 2011, 74 (9): 845-852.
7. Diopan V, Shestivska V, Zitka O, et al. Determination of Plant Thiols by Liquid Chromatography Coupled with Coulometric and Amperometric Detection in Lettuce Treated by Lead (II) Ions [J]. Electroanalysis, 2010, 22 (11): 1248-1259.
8. Kaiser J, Galiova M, Novotny K, et al. Utilization of the Laser Induced Plasma Spectroscopy for monitoring of the metal accumulation in plant tissues with high spatial resolution [J]. Networking IEEE/ACM Transactions on, 2010, 20 (4): 1096-1111.
9. Kaiser J, Galiova M, Novotny K, et al. Mapping of lead, magnesium and copper accumulation in plant tissues by laser-induced breakdown spectroscopy and laser-ablation inductively coupled plasma mass spectrometry [J]. Spectrochimica Acta Part B Atomic Spectroscopy, 2009, 64 (1): 67-73.
10. Krystofova O, Shestivska V, Galiova M, et al. Sunflower Plants as Bioindicators of Environmental Pollution with Lead (II) Ions [J]. Sensors, 2009, 9 (7): 5040-5058.
11. Kaiser J, Galiova M, Novotny K, et al. Mapping of the heavy-metal pollutants in plant tissues by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy [C]Spectrochimica Acta Part B 64 (2009) 67–73.
12. Galiova M, Kaiser J, Novotny K, et al. Investigation of heavy-metal accumulation in selected plant samples using laser induced breakdown spectroscopy and laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry [J]. Applied Physics A, 2008, 93 (4): 917-922.
13. Sona K, Pavel R, Olga K, et al. Multi-instrumental analysis of tissues of sunflower plants treated with silver(I) ions – plants as bioindicators of environmental pollution [J]. Sensors, 2008, 8 (1): 445-463.
14. Stejskal K, Mendelova Z, et al., Study of effects of lead ions on sugar beet [J]. ListyCukrovarnicke A Reparske, 2008, 124 (4): 116-119.
15. Galiova M, Kaiser J, Novotny K, et al. Utilization of laser induced breakdown spectroscopy for investigation of the metal accumulation in vegetal tissues [J]. Spectrochimica Acta Part B Atomic Spectroscopy, 2007, 62 (12): 1597-1605.
16. Kaiser J, Samek O, Reale L, et al. Monitoring of the heavy-metal hyperaccumulation in vegetal tissues by X-ray radiography and by femto-second laser induced breakdown spectroscopy [J]. Microscopy Research and Technique, 2007, 70 (70): 147-153.
AtomTrace團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用LIBS技術(shù)進(jìn)行植物中金屬元素分布的研究案例
浮萍（Lemna minor L.）是金屬元素環(huán)境污染的指示物種，也是常被用于金屬毒害和富集作用研究的模式生物。本案例中，AtomTrace團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用LIBS技術(shù)對(duì)浮萍做元素分布mapping，比較研究Cd鹽和QDs中的Cd元素在浮萍中的富集模式；并應(yīng)用傳統(tǒng)ICP-OES技術(shù)對(duì)不同含Cd化合物在浮萍中的含量和富集進(jìn)行測(cè)量；同時(shí)應(yīng)用TEM方法探究QDs的富集位置---浮萍表面、細(xì)胞內(nèi)部、還是植物組織內(nèi)。
注：Cd離子在2015年275種重要有害物質(zhì)清單中排名第7。含Cd量子點(diǎn)（QDs）通常由直徑3-6 nm的CdS、CdSe、PbSe及CdTe和其它一些金屬元素構(gòu)成，其外覆有有機(jī)聚合物。由于其染料效果優(yōu)于其它生物染料所以大量排放至水域中并在水中釋放出Cd離子，所以研究Cd量子點(diǎn)對(duì)生物的毒害作用有重要的應(yīng)用意義。
使用雙激發(fā)LIBS技術(shù)研究Cd元素在浮萍小葉中的分布情況
實(shí)驗(yàn)方法：
浮萍葉片分別在含鎘化合物CdCl2、MPA-QDs 及 GSH-QDs 溶液（該三種溶液濃度皆分別設(shè)為三個(gè)梯度：0.1、 1和 10 mg/L）中處理。將小葉貼于載玻片上制作樣品；
LIBS測(cè)量采用正交雙激發(fā)。一次激發(fā)激光波長(zhǎng)266nm，脈沖能量10mJ；二次激發(fā)激光波長(zhǎng)1064nm，脈沖能量1064mJ；兩次激發(fā)激光脈沖長(zhǎng)度均為5nm。每次測(cè)量均將葉片擊穿。
掃描測(cè)量分辨率：200μm；
Cd檢測(cè)主譜線：508.58 nm；
Fig. 4 Cd量子點(diǎn)及Cd鹽處理下浮萍小葉元素mapping圖像
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
CdCl2和Cd-QDs污染，對(duì)于Cd元素在浮萍葉片表面分布的影響無(wú)區(qū)別；
濃度不同，對(duì)于Cd元素在浮萍葉片表面分布的影響無(wú)區(qū)別；
實(shí)驗(yàn)中三種含鎘化合物（CdCl2、MPA-QDs、GSH-QDs）濃度升高，LIBS檢測(cè)信號(hào)皆隨之增強(qiáng)；
莖結(jié)處Cd元素富集作用明顯高于其它組織
引自：Pavlína, M., Karel, N., Pavel, P., J, K., P, L., H, Z.G., Jozef, K., 2018. Comparative investigation of toxicity and bioaccumulation of Cd-based quantum dots and Cd salt in freshwater plant Lemna minor L.[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety 147 (2018) 334–341
對(duì)植物組織的元素進(jìn)行LIBS mapping分析，可以通過(guò)譜線位置判別元素種類(lèi)，通過(guò)譜線強(qiáng)度得到元素濃度，而元素mapping圖像可以得到元素分布、以及若干種元素的相關(guān)位置分布信息。而在同一位置連續(xù)測(cè)量，即可得到元素剖面分布的3D信息。
Fig. 5 所示實(shí)驗(yàn)研究：
Fig. 5 A：萵苣葉片上，Pb元素對(duì)Mg元素分布的影響。Mg是葉綠素的關(guān)鍵金屬，而Pb元素對(duì)葉綠素卻有更強(qiáng)的親和性，因此葉片中Pb濃度上升時(shí)，Mg濃度下降。
Fig. 5 B：Pb處理使玉米葉片中Pb濃度增加。
Fig. 5 C：植物對(duì)金屬離子毒害的抗性各不相同。如圖中所示向日葵葉片中，Pb處理對(duì)Mg元素的分布無(wú)影響。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與形態(tài)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
Fig. 5 D：LIBS技術(shù)也可應(yīng)用于植物其它組織中的元素分析。如圖中所示松樹(shù)枝條的雙激發(fā)LIBS測(cè)量所得的3D元素分布圖。
Fig. 5
引自：Jozef, K., Karel, N., et al., Trace elemental analysis by laser-induced breakdown spectroscopy—Biologicalapplications. Surface Science Reports 67 (2012) 233–243
根部對(duì)于植物養(yǎng)分供應(yīng)、保護(hù)植物避免受到過(guò)量金屬離子的毒害方面發(fā)揮著重要作用，但是根部元素分析的難度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)莖部組織，原因包括：根通常要比莖和芽細(xì)小很多；干物質(zhì)含量小很多，為樣品切割帶來(lái)很大不便；通常待分析元素相對(duì)含量較低；而柔軟多汁的樣品如何保持其結(jié)構(gòu)形狀以得到元素分布的正確結(jié)果，同樣是個(gè)難題。
AtomTrace針對(duì)上述挑戰(zhàn)，在本案例中進(jìn)行了成功的探索---應(yīng)用雙激發(fā)LIBS技術(shù)對(duì)蠶豆幼苗根部納米銀顆粒（直徑為21.7±2.3 nm）進(jìn)行mapping分析，目標(biāo)是對(duì)自然狀態(tài)下的植物組織進(jìn)行元素檢測(cè)，獲得高mapping分辨率的同時(shí)確保檢測(cè)靈敏度。這同時(shí)也是整個(gè)LIBS領(lǐng)域中，對(duì)植物根部納米顆粒分布情況的初次嘗試。
LIBS雙激發(fā)技術(shù) ---即每次采集的測(cè)量信號(hào)，都為兩次激光脈沖激發(fā)。如此可減輕燒蝕擾動(dòng)并提高mapping分辨率；同時(shí)兩次激發(fā)可增強(qiáng)信號(hào)，以獲得可重復(fù)性更高、更優(yōu)LOD（檢測(cè)限）的檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)參數(shù)：二次激發(fā)脈沖能量分別為5MJ@266nm和100MJ@1064nm，間隔為500ns；測(cè)量頻率為1次/秒；實(shí)驗(yàn)在1個(gè)大氣壓下進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)材料：蠶豆幼苗，分辨在AgNP溶液、Cu 和Ag 離子溶液處理7天，做40μm厚切片進(jìn)行LIBSmapping測(cè)量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，LIBS技術(shù)檢測(cè)速度快；即使對(duì)直徑只有2mm的幼根，也可對(duì)其橫切面中的金屬離子及金屬納米顆粒分布進(jìn)行mapping分析，檢測(cè)的精確度和圖像分辨率足以滿足實(shí)驗(yàn)需求。應(yīng)用雙激發(fā)技術(shù)，Mapping分辨率可達(dá)到50μm，足以區(qū)分根表皮層、皮層、中柱中的元素分布特征。
此外，7天的短時(shí)間處理即可檢測(cè)結(jié)果，說(shuō)明對(duì)自然環(huán)境中、自然養(yǎng)分條件下的植物來(lái)說(shuō)，LIBS元素mapping也是元素分布檢測(cè)行之有效的實(shí)驗(yàn)方法，因此將是植物生理學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域中的有效應(yīng)用。
Fig.6蠶豆幼苗根橫切進(jìn)行分辨率為50μm的單線測(cè)量后，燒蝕坑情況
Fig.7 Cu 溶液處理蠶豆幼苗根橫切不同分辨率下mapping結(jié)果：100μm、75μm、50μm
Fig.8 不同濃度Cu2 溶液【a) 100 μmol l−1 Cu2 ；b)50 μmol l−1 Cu2 ；c) 10μmol l−1 Cu2 ； d) 0 μmol l−1 Cu2 】處理蠶豆幼苗根橫切mapping結(jié)果；e）樣品區(qū)特征譜線；f）Cu2 濃度降低，其對(duì)應(yīng)譜線強(qiáng)度也依次降低
Fig.8 Cu2 、Ag 、AgNPs處理7日后的蠶豆幼苗根部橫切的顯微圖像和元素mapping對(duì)應(yīng)結(jié)果（引自：Krajcarová L, Novotný K, Kummerová M, J. Dubová J, Gloser V, Kaiser J. Mapping of the spatial distribution of silver nanoparticles in root tissues of Viciafaba bylaser-inducedbreakdownspectroscopy(LIBS) [J], Talanta 173 (2017) 28–35.）
北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司是由科學(xué)家創(chuàng)建并為科學(xué)家提供頂尖科技服務(wù)的高新技術(shù)企業(yè)，是AtomTrace公司在中國(guó)（包括香港、臺(tái)灣地區(qū)）的獨(dú)家代理和技術(shù)咨詢服務(wù)中心。易科泰生態(tài)技術(shù)公司在青島、西安設(shè)有分公司，在全國(guó)各地設(shè)有辦事處，北京總部設(shè)立有EcoLab實(shí)驗(yàn)室以提供實(shí)驗(yàn)研究合作、儀器技術(shù)培訓(xùn)等。
