Jennifer Rottenberger¹, Paul Monnier², Maria Milla², Tobias Beyer², Dario Ossola², Justin S Antony¹and Markus Mezger¹

　　1 University Children's Hospital, Department of Pediatrics I, Hematology and Oncology, University of Tübingen, Tübingen, Germany

　　2 Cytosurge AG, Saegereistrasse 25, 8152 Glattbrugg, Switzerland

　　生物制藥和生物學(xué)研究以及生物制品的生產(chǎn)制造都依賴于基因修飾的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系的基因被修飾，以誘導(dǎo)所需的表現(xiàn)型。隨著CRISPR等基因編輯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展，多位點(diǎn)編輯越來(lái)越引起了研究者的重視，但實(shí)際研究表明，整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程冗長(zhǎng)而復(fù)雜。近期，來(lái)自德國(guó)圖賓根大學(xué)附屬兒童醫(yī)院的學(xué)者和來(lái)自瑞士Cytosurge公司工程師合作，通過(guò)FluidFM BOT技術(shù)手段，在不到三周的時(shí)間內(nèi)完成了多基因敲除的單克隆細(xì)胞系。

　　FluidFM BOT助力CRISPR實(shí)現(xiàn)新突破

　　自CRISPR作為一種基因編輯技術(shù)被發(fā)現(xiàn)和發(fā)展以來(lái)，它已經(jīng)徹底改變了許多生命科學(xué)的研究領(lǐng)域。它為科學(xué)家提供了一種高度通用的基因工程工具，已經(jīng)應(yīng)用于各種廣泛的生物體?？茖W(xué)家們對(duì)多基因位點(diǎn)編輯的多重策略的興趣也正在急劇地增加：多重gRNAs的使用可以大大增強(qiáng)CRISPR的應(yīng)用范圍。如多位點(diǎn)基因編輯，基因失調(diào)，細(xì)胞凋亡等。

　　用傳統(tǒng)技術(shù)手段包括轉(zhuǎn)染等方法將多個(gè)gRNAs傳遞到細(xì)胞中具挑戰(zhàn)。除了由幾次DNA雙鏈斷裂引起的DNA損傷反應(yīng)外，細(xì)胞活力也可能因物理?yè)p傷和化合物進(jìn)入細(xì)胞核所引起的毒性而大大降低。所有這些都大地限制了CRISPR多位點(diǎn)編輯的潛力和效率。

　　FluidFM BOT技術(shù)具，可將化合物直接輸送到任何細(xì)胞的細(xì)胞核中(圖1)。因此，所有的試劑可以調(diào)整為佳的配比劑量進(jìn)行注射，這樣大程度上提高了效率，降低了細(xì)胞所受的物理壓力，同時(shí)也減少了脫靶效應(yīng)。FluidFM BOT技術(shù)完全屏蔽了常規(guī)基因遞送方法的障礙，甚至CRISPR RNP復(fù)合物可以與數(shù)十甚至數(shù)百種不同的gRNAs共同注射。此外，F(xiàn)luidFM BOT的注射物不依賴于待注射物本身的特性，對(duì)于難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（如原代細(xì)胞）或需要大量的基因插入和沉默時(shí)候更具特優(yōu)勢(shì)。

圖1：FluidFM BOT技術(shù)可以溫和地操作單個(gè)細(xì)胞。

　　在傳統(tǒng)的細(xì)胞系發(fā)展系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中，為了得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，候選細(xì)胞系在增殖過(guò)程中被反復(fù)評(píng)估。目前需要的時(shí)間是12到14周。相比之下，通過(guò)FluidFM BOT技術(shù)可以挑選一個(gè)BOT注射編輯過(guò)的單個(gè)細(xì)胞，并從中產(chǎn)生克隆體——從轉(zhuǎn)染之日起直到克隆體被鑒定出來(lái)，不到三周的時(shí)間。大大提高了細(xì)胞系構(gòu)建的時(shí)間。

　　FluidFM BOT技術(shù)進(jìn)行多基因敲除構(gòu)建細(xì)胞系

　　接下來(lái)，我們將展示如何使用FluidFM BOT技術(shù)在不到三周的時(shí)間內(nèi)生成單克隆多敲除細(xì)胞系(圖2)。先，通過(guò)FluidFM BOT技術(shù)將外源物注射到CHO細(xì)胞中，同時(shí)靶向幾個(gè)不同基因的基因組位點(diǎn)，直接將gRNA/Cas9 RNP復(fù)合物導(dǎo)入細(xì)胞核。納米注射后，記錄每個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的位置，這樣以便在注射24小時(shí)后使用FluidFM BOT探針進(jìn)一步分離成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。然后將這些細(xì)胞擴(kuò)展成單克隆細(xì)胞系。接下來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，以確定基因編輯是否成功。

圖2：FluidFM BOT技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞株開(kāi)發(fā)流程：第1天，細(xì)胞經(jīng)FluidFM BOT注射轉(zhuǎn)染。第2天，選擇成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過(guò)FluidFM BOT系統(tǒng)進(jìn)一步進(jìn)行單細(xì)胞分離。從第3天到第14天，分離的單細(xì)胞擴(kuò)展成穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞系，并對(duì)其基因組進(jìn)行分析。

　　第1天：FluidFM BOT單細(xì)胞注射轉(zhuǎn)染

　　通過(guò)FluidFM BOT技術(shù)進(jìn)行納米注射，簡(jiǎn)單的點(diǎn)擊鼠標(biāo)即可完成對(duì)幾十個(gè)CHO細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行注射，以大約5個(gè)細(xì)胞/分鐘的速度自動(dòng)完成注射。熒光標(biāo)記物與所有不同的gRNA/Cas9 RNP復(fù)合物共注射，以方便監(jiān)測(cè)注射過(guò)程并識(shí)別佳候選復(fù)合物(圖3)。

圖3：FluidFM BOT注射CRISPR/Cas9復(fù)合物和熒光標(biāo)記物的CHO細(xì)胞的熒光圖像。

　　第2天：FluidFM BOT進(jìn)行單細(xì)胞分離和分選

　　FluidFM BOT對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了注射轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，使用集成FluidFM BIO系列操作軟件(ARYA)可以再次的找到所有目標(biāo)細(xì)胞。進(jìn)而，進(jìn)行FluidFM BOT進(jìn)行單細(xì)胞分離和分選，將目標(biāo)單細(xì)胞采用孔徑為4 μm的FluidFM探針進(jìn)行單分離，放入空的孔板中(圖4)。從視覺(jué)上可以完全確保細(xì)胞系的單克隆性。

圖4：明場(chǎng)成像可以完全確保細(xì)胞系的單克隆性。

　　第3 - 14天：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞的擴(kuò)增和突變分析

　　分離后培養(yǎng)克隆，并在3天和6天后監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)情況(圖5.1和5.2)。90%以上的分離細(xì)胞發(fā)育成一個(gè)細(xì)胞群落。轉(zhuǎn)染后14天，收集克隆并對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序分析。50%的克隆在靶向位點(diǎn)上顯示突變。

圖5.1：分離3天后的12組CHO細(xì)胞集落。

圖5.2：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞群落生長(zhǎng)6天后

　　結(jié)論

　　結(jié)果表明，通過(guò)FluidFM BOT技術(shù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行注射，完成了多個(gè)gRNAs同時(shí)遞送到選定的單個(gè)細(xì)胞中這一艱難的任務(wù)。采用FluidFM BOT技術(shù)方法進(jìn)行的CRISPR細(xì)胞編輯技術(shù)，同時(shí)共注入幾十種gRNAs所獲得的細(xì)胞系可以進(jìn)一步擴(kuò)增。此外，我們?cè)谶@里證明了FluidFM BOT技術(shù)的使用大大減少了多表型單克隆細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)時(shí)間，從數(shù)月減少到三周。

　　展望

　　FluidFM BOT技術(shù)為單細(xì)胞基因工程領(lǐng)域帶來(lái)了全新的突破，有潛力解決科學(xué)家目前面臨的一些艱巨的挑戰(zhàn)，尤其是在他們需要快速和有效地開(kāi)發(fā)單克隆細(xì)胞系時(shí)。傳統(tǒng)的方法完全適用于常見(jiàn)的細(xì)胞系和基因工程策略，但當(dāng)處理不常見(jiàn)的、罕見(jiàn)的或脆弱的、和已知難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞類型，或者需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)——例如CRISPR多基因編輯時(shí)，傳統(tǒng)的方案就非常受限制。在這些特殊情況下，F(xiàn)luidFM BOT技術(shù)可能是可用的解決方案。

　　相關(guān)產(chǎn)品

　　瑞士Cytosurge多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)-FluidFM BOT：http://www.buyu5683.com/product/2018082713.shtml