單細胞測序在疾病診斷和細胞異質(zhì)性研究中發(fā)揮著重要作用。然而目前的單細胞測序手段需要將細胞消化并裂解才能夠進行，而細胞狀態(tài)在這一操作中不可避免的會發(fā)生改變，因此很難掌握細胞真實的基因表達情況，尤其對于基因通路上表達變化的檢測為不利。近期蘇伊士理工大學使用FluidFM創(chuàng)建了一種原位活細胞基因測序方法，這種方法能夠在不殺死細胞的情況下完成對細胞的測序工作。通過這種技術該團隊成功完成單細胞RNA基因測序，并通過這種方法檢測到了細胞的基因表達和細胞周期狀態(tài)變化。下面本文就這項工作的具體內(nèi)容進行闡述。
1. Live-Seq測序技術簡述
由于單個細胞的RNA總量僅有10 pg。為了實現(xiàn)無損的單細胞測序，該團隊先使用FluidFM對現(xiàn)有的scRNA-Seq單細胞測序的方法進行了優(yōu)化。為了盡可能的接近Smart-Seq的測試條件，該團隊采用了先將緩沖液吸入探針，然后再進行細胞提取的操作。這樣可以確保所提取的RNA能夠很快與緩沖液混合，從而避免RNA的降解。通過這一方法，該團隊成功實現(xiàn)了IBA細胞的測序，證明了這種方法的可行性（圖1）。
圖1. Live-Seq技術
a. Live-Seq技術的示意圖和代表圖片，黑色箭頭指代液面；b. IBA細胞測序的質(zhì)量控制圖（n=10）。
2. Live-Seq技術分析細胞系和細胞狀態(tài)
為了證實Live-Seq的有效性，該團隊對多種細胞系進行了測序，這其中包括IBA細胞、小鼠脂肪干細胞和祖細胞（ASPCs）以及脂多糖處理的RAW264.7細胞和Mock處理的RAW264.7細胞。通過對這些細胞系進行測序發(fā)現(xiàn)，該方法能夠區(qū)分上述細胞系，并且在特征基因檢測中能夠找到每種細胞所對應的特征基因，證明了Live-Seq方法的有效性（圖2）。
圖2. Live-Seq單細胞測序區(qū)分細胞型及細胞狀態(tài)
a. 實驗方法示意圖，使用LPS和PBS對RAW細胞進行處理；b. 前500個高度易變基因的tSNE圖；c. 前十的細胞型、細胞狀態(tài)差別基因的熱圖；d. 小鼠基因圖譜預測，使用前100個標記基因的團簇；e. Live-Seq對比scRNA-Seq的錨點分析，顯示兩者沒有顯著差異。
3. Live-Seq技術對細胞的活力基本沒有影響
Live-Seq技術的顯著優(yōu)勢在于提取過程中不會破壞細胞。通過對提取前后的測序?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn)，提取組與空白組之間的團簇沒有顯著性差異。并且通過對細胞形態(tài)的觀察，發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)基本沒有改變，并且多數(shù)細胞仍然能夠正常分裂（圖3）。
圖3. Live-Seq對細胞活力的影響
a. 細胞實驗的示意圖；b. Live-Seq測序后不同時間點（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE圖；c.不同時間點scRNA-Seq所有能夠發(fā)現(xiàn)差異的基因（共12個）；d.不同時間點的細胞形態(tài)圖片。
4. Live-Seq技術能夠記錄細胞下游分子表型事件
由于Live-Seq對細胞生理狀態(tài)影響小，因此能夠監(jiān)測在細胞代謝過程中的基因變化。通過對比LPS處理的巨噬細胞周期實驗發(fā)現(xiàn)，Live-seq技術與對照組的細胞代謝水平相比沒有明顯變化，因此這種方法測量的數(shù)據(jù)十分接近細胞代謝中基因表達的真實水平。通過測序?qū)Ρ萀PS處理與空白的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nfkbia與Tnf的表達大為相關。這一結(jié)果也驗證這種測序方法在檢測細胞下游表型時的優(yōu)勢。
圖4. Live-Seq技術的單細胞縱向分析
a. 實驗示意圖；b. 不同處理細胞的mCherry強度變化；c. 3~7.5h之間mCherry強度變化；d. Tnf-mCherry強度變化的線性回歸模型；e. Nfkbia與Tnf在Live-Seq測序中的表達關系；f. Nfkbia與Tnf在scRNA-Seq測序中的表達關系；g. Live-Seq測序中細胞處于S期的評分；h. Live-Seq測序中細胞周期的mTnf-mCherry強度變化；i.Tnf-mCherry的熒光強度增量（3~7.5h）。
5. Live-Seq技術對同一細胞多次測序
Live-Seq技術的無損性甚至能夠?qū)崿F(xiàn)對單個細胞的多次測序。通過對單個細胞兩次提取后細胞活力變化的觀察中發(fā)現(xiàn)，細胞的活力即使在2次提取后仍沒有發(fā)生明顯的變化，基因型分析也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的基因表型改變。
圖5. Live-Seq對細胞的多次提取
j.連續(xù)測序的示意圖和代表圖像；k.Live-Seq的tSNE圖；l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE圖。
6. 總結(jié)
Live-Seq是一種十分具有前景的單細胞測序的新方法，得益于FluidFM技術的無損提取的優(yōu)勢，Live-Seq技術除了能夠?qū)崿F(xiàn)傳統(tǒng)測序的功能外，還降低了細胞的損傷，能夠提供更加原生和真實的測序信息。這種特點甚至讓單細胞的基因表達動力學研究成為可能。相信隨著這種技術自動化的提高，將為單細胞測序技術帶來更多可能。
參考文獻：
[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. G?belein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752;
DOI: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752
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