基因編輯， “何方神圣”
基因編輯是一種對靶基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行敲除、插入和定點突變等精確修飾的基因工程技術(shù)，主要通過人工核酸酶實現(xiàn)對基因組的特定基因序列的敲除、插入或精確修飾。目前，主要有三大基因編輯技術(shù)，包括：鋅指核酸酶 (Zinc finger nucleases; ZFNs) 技術(shù)，轉(zhuǎn)錄靈活因子樣效應物核酸酶 (transcription activator-like (TAL) effector nucleases; TALENs) 技術(shù)和 CRISPR/Cas9 技術(shù)。
ZFNs 是較早用于基因組編輯的人工合成的限制性內(nèi)切酶，該酶是異源二聚體，包含 DNA 結(jié)合鋅指蛋白 (ZFP) 結(jié)構(gòu)域和非特異性 FokI 核酸酶結(jié)構(gòu)域。DNA 切割域的 FokI 核酸酶必須二聚化以切割 DNA。該技術(shù)已被用于修飾各種生物體內(nèi)的內(nèi)源性基因。
與 ZFNs 的模塊化結(jié)構(gòu)一樣，TALENs 的羧基末端也含有 FokI 核酸酶結(jié)構(gòu)域，它借助 TALEs (來源于植物致病性黃單胞菌屬細菌) 來識別特異性 DNA 堿基對。相較于 ZFNs 技術(shù)，其優(yōu)勢在于可以定點識別靶基因，從而使得基因編輯更加準確有效，其脫靶效應以及細胞毒性也得到了顯著改善。
圖 1. 不同基因編輯手段的對比
2020 年，兩位女性科學家 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 因發(fā)現(xiàn) CRISPR/Cas9 基因剪刀，而獲得 2020 年諾貝爾化學獎。
CRISPR/Cas 系統(tǒng)由一小段 RNA 和一種有效的 DNA 切割酶 (Cas 核酸酶) 組成的系統(tǒng)，該技術(shù)不像 TALENs 技術(shù)和 ZFNs 技術(shù)是依賴于蛋白與靶基因之間的識別，而是由 sgRNA 和靶基因之間形成復合物，從而完成特定基因序列的編輯。
CRISPR/Cas9 技術(shù)切割效率相對較高且操作簡單，并且可以同時進行多位點的編輯?？傊?，三種不同的基因編輯技術(shù)都有其各自的特點。今天小 M 的“重頭戲”，CRISPR/Cas9。
CRISPR/Cas9 的調(diào)控機制
在細菌及古細菌中，CRISPR 系統(tǒng)共分成 3 類，其中 I 類和 Ⅲ 類需要多種 CRISPR 相關(guān)蛋白 (Cas 蛋白) 共同發(fā)揮作用。而來自 Streptococcus pyogenes 的 Ⅱ 型系統(tǒng)只需要一種 Cas 蛋白 (Cas9) 即可發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性。因此，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應用成為廣泛。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞。
■ 一步：捕獲外源 DNA
Cas9 蛋白包含兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域：切割非互補 DNA 鏈的 RuvC 結(jié)構(gòu)域和切割互補 DNA 鏈的 HNH 結(jié)構(gòu)域 (如圖 2a)。
噬菌體等外源 DNA 入侵時，CAS 蛋白復合物通常識別 3' 端含 NGG 的前間隔序列鄰近基序 (PAM) 區(qū)域。然后，侵入的噬菌體或質(zhì)粒釋放的短 DNA 片段(稱為 Protospacer)，插入宿主 CRISPR 位點中 (由重復序列隔開)。
■ 第二步：crRNA 合成
CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄，形成前體 CRISPR RNA (pre-crRNA)。Cas9 及 RNase III 在 tracrRNA 與 pre-crRNA 上的重復序列配對形成雙鏈 RNA 的條件下，對 pre-crRNA 進行剪切，形成成熟的 tracrRNA-crRNA 雙鏈 RNA (即 sgRNA)。Cas9 核酸酶和 sgRNA 形成 Cas9 核糖核蛋白 (RNP)。
■ 第三步：靶向干擾
當外源 DNA 再次進入細胞時，Cas9 蛋白攜帶sgRNA，去識別外源 DNA 的 Protospacer (前間隔序列)，并與之結(jié)合，通過 Cas9 解旋酶和核酸酶對靶基因進行剪切。造成靶基因 DNA 的雙鏈斷裂 (DSB)，從而達到干擾靶基因表達的目的，在修復斷裂同時引入基因敲除或敲入。
圖 2. 通過非同源末端連接 (NHEJ) 或同源定向修復 (HDR) 內(nèi)源性修復雙鏈 DNA 斷裂[2]
綜上，CRISPR 技術(shù)主要是利用位點特異 Cas 核酸酶在基因組靶位點處引入 DNA DSB，再經(jīng)細胞自身的非同源末端連接 (NHEJ) 或同源重組修復 (HDR) 對 DSB 進行修復，實現(xiàn)目標基因敲除和堿基編輯等基因組遺傳修飾。
CRISPR/Cas9 的小分子調(diào)控策略
CRISPR技術(shù)在疾病治療、基因功能調(diào)控、藥物研發(fā)等多個方面具有廣闊的應用前景，但也存在脫靶、基因毒性等副作用問題。由于Cas9 蛋白和sgRNA 在其自身活性、識別位點及結(jié)合能力等方面的不同特性，因此在應用中可以通過對 Cas9 蛋白酶以及與靶 DNA的結(jié)合進行有效的調(diào)控。目前，如：遺傳調(diào)節(jié)、小分子靈活劑、小分子抑制劑、生物響應性輸送載體以及 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的光/熱/超聲/磁靈活等方法已被研究開發(fā)。
■ 小分子靈活劑控制 Cas9 活性的策略
可通過添加小分子來控制 Cas9 的構(gòu)象變化，來實現(xiàn)對 Cas9 蛋白活性的時空控制。
案例 1：當內(nèi)含肽插入 Cas9 蛋白的不同位點，Cas9 核酸酶失活；添加 4-HT (4-hydroxytamoxifen)，通過構(gòu)象變化和自切割反應去除內(nèi)含肽，可重新靈活 Cas9 蛋白（圖 3a）。根據(jù)內(nèi)含肽的插入位點，Cas9 的靈活效率 3 倍到 10 倍不等，與野生型 Cas9 相比，這種調(diào)控策略可增加開/脫靶效應比率。
圖 3. 小分子靈活劑控制 Cas9 活性的策略[9]
a：通過 4-HT 結(jié)合，恢復失活的 Cas9 活性；b：Cas9 和雌激素受體 (ERT2) 的融合被分離在細胞質(zhì)中，通過添加 4-HT 使得融合物進入細胞核，形成 Cas9/sgRNA 復合物
案例 2：基于化學誘導的 Cas9 蛋白分裂片段的二聚化。Zetsche 等人設計了不同的分裂位點(Arg535 和 Glu573)生成分裂 Cas9 (split-Cas9) 蛋白，同時產(chǎn)生 C 端和 N 端Cas9 片段 (可分別與 FK506 結(jié)合蛋白 (FKBP) 和 FKBP 雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (FRB) 結(jié)合)。這種方法通過雷帕霉素誘導的異源二聚作用實現(xiàn)了 split-Cas9 的條件重構(gòu)和靈活。
圖 4. 小分子靈活劑控制 Cas9 活性的策略[9]
■ 小分子抑制劑控制 Cas9 活性的策略
由于 Cas9 活性的升高和持續(xù)可能會導致脫靶效應、染色體易位和遺傳毒性，因此在目標編輯后，Cas9 核酸酶活性必須迅速限制在一個狹窄的時間范圍內(nèi)。
如下圖 5 所示，DHFR (ER50)是一個不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域，可快速靶向 Cas9 蛋白進行蛋白酶體介導的 Cas9 降解，但添加小分子抑制劑甲氧芐氨嘧啶 (TMP) 或 4-OHT 后可以使其穩(wěn)定。用 Cas9-DHFR 或 Cas9-ER50 系統(tǒng)編輯 VEGFA 基因時，用不同劑量的TMP 或 4OHT 劑量依賴性控制靶向 VEGFA 基因的復合物 Cas9-DHFR (ERR50) 的靶向和非靶向活性。
圖 5. 小分子抑制劑控制 Cas9 活性的策略[9]
總結(jié)
CRISPR-Cas9 系統(tǒng)已成為一種在任何細胞基因組的精確位置進行修改的有效工具。Cas9 介導的 DNA 切割后發(fā)生的主要細胞修復途徑是錯誤的非同源末端連接 (NHEJ) 途徑。同源定向重組 (HDR) 的效率遠遠低于 NHEJ。因此，降低 NHEJ 的頻率，同時增加 Cas9 介導的 DNA 切割后的 HDR 效率，從而提高基因組編輯的整體效率和精準度成為科學家關(guān)注的焦點。與此同時，通過研究人員的不斷努力，生物活性小分子提供了一種簡單而有效的調(diào)控策略，可進一步拓寬精確基因組編輯的應用范圍。
相關(guān)產(chǎn)品
一種 RAD51 的靈活劑，同時可增強 CRISPR/Cas9 的活性。
可逆的microtubule抑制劑。Nocodazole 抑制 Bcr-Abl，增強CRISPR/Cas9的活性。
一種內(nèi)酯抗生素，是蛋白質(zhì)運輸?shù)奶囟ㄒ种苿?。Brefeldin A 還是一種 CRISPR/Cas9 激動劑，可抑制 HSV-1病毒，并具有抗癌活性。
一種DNA 連接酶 IV (DNA ligase IV) 抑制劑。SCR7 pyrazine 也是一種 CRISPR/Cas9的增強子，可提高 Cas9 介導的同源性定向修復 (HDR) 的效率。
一種不穩(wěn)定的形式，可以自動循環(huán)成穩(wěn)定形式的 SCR7 pyrazine是一種 CRISPR/Cas9 的增強子，可提高 Cas9 介導的同源性定向修復 (HDR) 的效率
一種核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)，有潛力用于 HIV 感染的研究。Zidovudine 增強 CRISPR/Cas9調(diào)節(jié)的編輯頻率。
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參考文獻
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