雞 (學(xué)名：Gallus gallus domesticus) 是最常見的家禽之一，是全球肉類和蛋白質(zhì)的重要來(lái)源。雞體型小、易繁殖、孵化期短 (僅 21 天)，性狀優(yōu)良的蛋雞甚至在一年中的 316 天都在產(chǎn)蛋。根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局的數(shù)據(jù)顯示，2021 年全國(guó)白羽肉雞出欄量有 65.32 億只，蛋雞存欄量有 10.50 億只?？梢婋u對(duì)人類的飲食結(jié)構(gòu)有著不可替代的作用。

　　圖 1. 剛出雛兩天的雞寶寶；圖 2. 用保鮮膜殼外培養(yǎng)的雞胚

　　除了吃以外，雞對(duì)脊椎動(dòng)物的發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、生理學(xué)等研究領(lǐng)域也有不小的貢獻(xiàn)。

　　雞是第一個(gè)進(jìn)行基因組測(cè)序的家禽，基因組大小為 1.06 G，是人類的三分之一，但與人類基因組的同源性高達(dá) 60%。這也是為什么禽流感會(huì)成為人獸共患病的原因。

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　　雞胚的整個(gè)發(fā)育過程都在體外 (蛋殼中) 進(jìn)行，可以直觀地觀察到每一個(gè)發(fā)育過程。因此，雞胚也一直被用作模式生物來(lái)研究發(fā)育中的胚胎。除此之外，雞蛋還可作為生物反應(yīng)器，進(jìn)行基因編輯后可以讓母雞產(chǎn)下的蛋中含有難以體外合成的藥用蛋白。

如何對(duì)雞進(jìn)行基因編輯？

　　目前效率較高的雞基因編輯方法主要有兩種：PGC 編輯法和精子載體法。

　　PGC 編輯法

　　原始生殖細(xì)胞 (PGCs) 是高度特化的細(xì)胞，起源于外胚層，最初位于 X 期胚胎透明區(qū)的中心位置。在孵化至 3-4.5 天時(shí)，PGC 遷移到生殖脊，隨著性腺的發(fā)育，分化為雌性或雄性配子^[1]。對(duì) PGC 的編輯可從源頭改變基因型，因此，它成為制備基因編輯雞的理想選擇。將編輯后的 PGCs 后注入受體胚胎產(chǎn)生嵌合體，培育至性成熟后，嵌合體之間再交配，就有概率能夠從后代中獲得基因編輯后的純合體。Ioannidis 等人使用 PGC 編輯法在受精卵中敲除性別決定基因 DMRT1，獲得 DMRT1 缺失個(gè)體，雄性 DMRT1 缺失個(gè)體表現(xiàn)出雌性性狀，這直接證明了 DMRT1 劑量是鳥類的關(guān)鍵性別決定因素，對(duì)睪丸發(fā)育至關(guān)重要^[2]。

圖 3. PGC 編輯法獲得 DMRT1 突變體的過程^[2]

　　將雄性 PGCs 編輯后注射到雄性受精卵中，由此獲得缺失一個(gè)等位 DMRT1 的雄雞 (Z^D+Z^D-)，性成熟后與野生型母雞 (Z^D+W) 交配，獲得具有四種基因型的子代：野生型雌雄雞 (Z^D+Z^D+、Z^D+W) 和突變型雌雄雞(Z^D+Z^D-、Z^D-W)

　　精子載體法

　　精子載體法是將精子在體外進(jìn)行基因編輯后遞送到受體母雞中，從而產(chǎn)生基因敲除后的后代。這一方法彌補(bǔ)了 PGC 細(xì)胞難以體外培養(yǎng)的不足。Cooper 等人使用精子轉(zhuǎn)染輔助基因編輯的方法同樣將 DMRT1 用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除，編輯效率為 0~26%^[3]。

　　剛剛提到的 CRISPR/Cas9是近幾年非?；鸨幕蚓庉嫾夹g(shù)。

　　CRISPR 系統(tǒng)最早是由日本研究者石野良純于 1987 年定義的。這個(gè)系統(tǒng)特異性地存在于大多數(shù)細(xì)菌和古生菌基因組中，能夠抵抗噬菌體對(duì)細(xì)菌的破壞，被認(rèn)為是細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)^[4]。目前廣泛使用的 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)是由細(xì)菌的適應(yīng)性免疫機(jī)制類型 II 改造的。Jinek 等人通過融合 crRNA 和 tracrRNA 構(gòu)造了一種更簡(jiǎn)單的引導(dǎo) RNA——sgRNA (single guide RNA)^[5]，通常只有 20 nt。這一創(chuàng)新的出現(xiàn)簡(jiǎn)化了 CRISPR/Cas9 技術(shù)的操作過程。sgRNA 能與靶序列互補(bǔ)配對(duì)，引導(dǎo) Cas 蛋白對(duì)靶基因進(jìn)行切割。因此，設(shè)計(jì)出一個(gè)特異性高的 sgRNA 是這項(xiàng)技術(shù)成功的關(guān)鍵因素之一。

圖 4. 細(xì)菌的三種適應(yīng)性免疫機(jī)制^[4]

　　我們一起來(lái)看看 CRISPR/Cas9 在雞上是如何應(yīng)用的吧~

　　在哺乳動(dòng)物中已證明肌生成抑制素基因 (MSTN) 在哺乳動(dòng)物的肌肉生長(zhǎng)中發(fā)揮重要的作用，破壞該基因能增強(qiáng)骨骼肌的形成，可能有利于肌肉性狀的改良。Xu 等人利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在雛雞中敲除 MSTN 基因，與對(duì)照組相比，多數(shù)差異基因及 GO terms 與細(xì)胞增殖分化、肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、能量代謝等過程相關(guān)^[6]。

　　禽流感病毒一直是危害人類健康及阻礙禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的敵人。研究表明，甲型流感病毒 (IAV) 能夠通過雞的 ANP32A 蛋白進(jìn)行復(fù)制，用 CRISPR/Cas9 在雞胚成纖維細(xì)胞 (DF-1) 中編輯 ANP32 基因，使之缺乏完整的 ANP32A 后，感染病毒滴度與對(duì)照組相比顯著降低^[7]。這為抗禽流感品種的培育提供了新思路。

　　基因編輯還能使雞成為生物反應(yīng)器。Oishi 等人使用 CRISPR/Cas9 技術(shù)將 hIFN-β cDNA 引入 PGC，制備了基因編輯雞，成功使編輯母雞在其管狀腺體中表達(dá) hIFN-β，并在蛋清中產(chǎn)下含有大量 hIFN-β 的雞蛋^[8]。這一發(fā)現(xiàn)能為雞蛋在生物制藥生產(chǎn)中開辟新途徑。

　　圖 5. 敲入 hIFN-β cDNA 的基因編輯雞產(chǎn)出的蛋清中含有 hIFN-β

a：野生型母雞 (WT) 產(chǎn)下的雞蛋；b：敲入 hIFN-β cDNA 的母雞 (KI) 產(chǎn)下的雞蛋，蛋清中有白色絮狀物 (white cloud, Wc)；c：通過 SDS-PAGE 評(píng)估 KI 和 WT 母雞蛋清中 hIFN-β 的產(chǎn)生。左 1 泳道為 WT蛋清，左 2 泳道為 KI 蛋清白色絮狀物 (箭頭為 hIFN-β 條帶)，左 3 泳道為 KI 蛋清透明部分

　　然而，與哺乳動(dòng)物相比，雞的受精卵結(jié)構(gòu)和產(chǎn)卵過程較復(fù)雜 (雞蛋產(chǎn)出后就有已有 6 萬(wàn)多個(gè)細(xì)胞)，無(wú)法獲得單個(gè)卵子，因此，基因編輯在雞上的應(yīng)用與發(fā)展不那么一帆風(fēng)順，目前依然存在編輯效率較低、純合體制備周期長(zhǎng)等局限。

　　雞基因編輯之路，道阻且長(zhǎng)，但是，編輯技術(shù)始終在發(fā)展中，相信在未來(lái)科研工作者們能夠突破這些壁壘。

　　參考文獻(xiàn)

　　1. B. C. Li, et al. Relationship between PGCs Settle and Gonad Development in the Early Chicken Embryo. Anim Biosci 2004;17(4):453-459.

　　2. Ioannidis J, et al. Primary sex determination in birds depends on DMRT1 dosage, but gonadal sex does not determine adult secondary sex characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Mar 9;118(10):e2020909118.

　　3. Cooper CA, et al. Generation of gene edited birds in one generation using sperm transfection assisted gene editing (STAGE). Transgenic Res. 2017 Jun;26(3):331-347.

　　4. Hsu PD, et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-1278.

　　5. Jinek M, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.

　　6. Xu K, et al. Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle. Int J Mol Sci. 2020 Apr 8;21(7):2584.

　　7. Long JS, et al. Species specific differences in use of ANP32 proteins by influenza A virus. Elife. 2019 Jun 4;8:e45066.

　　8. Oishi I, et al. Efficient production of human interferon beta in the white of eggs from ovalbumin gene-targeted hens. Sci Rep. 2018 Jul 5;8(1):10203.