外泌體是包含了復雜 RNA 和蛋白質的小膜泡，是細胞間信號傳輸?shù)妮d體。多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，它們廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等體液中，參與細胞間通訊。近年來，外泌體的研究熱度持續(xù)攀升，已成為當前生命科學和基礎醫(yī)學研究的一大熱點，在2023 年國家自然科學基金獲批項目中，外泌體研究相關項目的總數(shù)近390個，立項的總金額突破1.5 億元。但受限于外泌體的尺寸（30~200 nm），常規(guī)的光學顯微鏡無法對其進行成像分析，因此很少有技術能夠對單個外泌體進行物理表征和蛋白分型。美國 NanoView Biosciences 公司推出的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng) ExoView R200系統(tǒng)，采用了特殊的 SP-IRIS成像技術，只需要少量樣品即可一次完成外泌體計數(shù)、粒徑、蛋白表達、蛋白共定位、亞群分布的分析。全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)   ExoView R200于 2018 年被推出后，便引起了外泌體領域科研工作者的廣泛關注，目前在全球已近100 多個實驗室采用該技術，發(fā)表文獻數(shù)百篇。本文選取了3 篇在高水平期刊《Journal of Extracellular Vesicle》（JEV）發(fā)表的比較有代表性的文章，來說明 ExoView在外泌體的表面電荷、內源性釋放的腫瘤源性外泌體、腺相關病毒載體等研究領域的具體應用。

全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng) ExoView 系統(tǒng)

　　? 決定外泌體表面電荷的關鍵因素

　　外泌體在生命科學系統(tǒng)的生理和病理過程中發(fā)揮了重要作用，但是由于其不確定性導致開發(fā)外泌體診斷方法以及治療方法更加艱巨和復雜。早先研究證明外泌體帶有負電荷，而且可通過經典方法計算外泌體的zeta 電位，但是這些研究忽略了外泌體表面緊密結合的離子的影響，低估了納米級別的zeta電位，而且目前還未有系統(tǒng)地量化研究外泌體的表面電荷。Sara Hassanpour Tamrin^[3]等考慮到緊密結合的離子的影響，通過對外泌體的電泳遷移率、 zeta   電位以及價態(tài)進行關聯(lián)分析來準確分析外泌體的表面電荷，這有助于開發(fā)外泌體的診斷和治療方法。

　　研究人員將實驗樣本分成三組，分別是從脂肪間充質干細胞 ( AMSCs )的培養(yǎng)上清液中提取外泌體的樣本組（isolated EV   fractions），培養(yǎng)上清液組（culture supernatant）以及新鮮培養(yǎng)基組（  fresh culture medium），后兩組為對照組。與

　　ExoView芯片上 CD63 抗體結合的外泌體的熒光強度與直徑的對比分析散點圖顯示，被捕獲的樣品組外泌體的平均直徑為56 ± 8 nm(圖 1A)。此外，研究人員通過標記外泌體相關表面標記物（CD81、CD63 和 CD9）、內容物Syntenin-1和非外泌體的細胞碎片的內質網標記物GRP94，分析了樣品組顆粒的組分；ExoView 結果表明四跨膜蛋白 CD9、CD81 和 CD63 存在于樣品組中（圖 1B），內容物標記物Syntenin-1表達水平非常明顯，而作為外泌體陰性標記物GRP94 的表達處于非常低的水平（圖 1C）。另外，被CD63 抗體捕獲的外泌體的蛋白共定位餅圖顯示樣品組中存在大量共定位外泌體，這些顆粒至少表達兩個或多個特異性生物標記物（圖1D）?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明樣品組含有大量的外泌體。除此之外，樣本組，培養(yǎng)上清液組、新鮮培養(yǎng)基組的共定位分析（圖2A-C）闡明新鮮培養(yǎng)基組幾乎沒有共定位顆粒，而樣本組的共定位顆粒比例比培養(yǎng)上清液組更大。

圖1    ExoView檢測 AMSCs樣本組的外泌體的熒光強度與直徑的對比、數(shù)量和進行共定位分析

圖2    ExoView對 AMSCs樣本組、培養(yǎng)上清液組以及新鮮培養(yǎng)基組進行共定位分析

　　? 在轉移前生態(tài)位捕獲異種移植腫瘤內源性釋放的外泌體可誘導炎癥反應

　　早前研究證明腫瘤源性外泌體（ TEV ）有助于轉移前生態(tài)位（ PMN ）的形成，然而尚未有研究系統(tǒng)地分析 PMN 響應內源釋放 TEV 形成的動力學。Laurence Blavier^[1]等在小鼠體內原位植入轉移性人類黑色素瘤 ( MEL ) 和神經母細胞瘤 ( NB ) 細胞，通過 GFP 標記內源性釋放的 TEV 以及它們被宿主細胞捕獲，揭示了 TEV 對轉移的重要作用。另外，TEV 在未來轉移部位的捕獲與 miR-1246 向肺巨噬細胞、肝巨噬細胞和星狀細胞的轉移相關。研究人員證明在PMN捕獲內源性釋放的 TEV 具有器官親和性，TEV 誘導了炎癥基因表達的動態(tài)變化，使其變?yōu)榇倌[瘤反應。

　　其中，研究人員使用

　　ExoView對從植入MEL 和 NB 的小鼠和對照組小鼠的血漿分離的外泌體進行檢測，結果顯示樣品組中被人源 CD63、CD81、CD9抗體捕獲的外泌體數(shù)量明顯多于對照組，而且人源 CD63和 CD81抗體捕獲的外泌體數(shù)量也明顯高于CD9抗體捕獲的外泌體數(shù)量，這表明樣品組存在大量人源外泌體，而對照組幾乎檢測不到。

圖 3  ExoView 檢測從植入MEL和NB的小鼠和對照組小鼠的血漿分離的外泌體的數(shù)量

　　? 氣管內給藥后，外泌體可增強穩(wěn)定結合的腺相關病毒的肺轉導

　　腺相關病毒 (AAV) 載體在臨床研究已獲得多項突破，但由于難以轉導肺氣道細胞，AAV載體在吸入基因治療中的臨床應用仍未被破解。Gijung Kwak^[2]等研究發(fā)現(xiàn)與 AAV血清型6（AAV6）的標準制劑相比， AAV6 與外泌體（EV）制備的載體（EVAAV6）在原代人支氣管、鼻上皮細胞以及小鼠肺氣道的粘液覆蓋的氣液界面(ALI) 培養(yǎng)物中展示了明顯更強的轉基因表達，并且 EVAAV6 的出色功能是基于外泌體可促進粘液滲透和 AAV6 進入和轉導細胞的能力。

　　Gijung Kwak等使用ExoView對 EVAAV6 組和對照組中的外泌體表型進行分析。在實驗中，研究人員使用四跨膜蛋白CD81、CD63、CD9的特異性抗體對樣品中的外泌體進行捕獲，之后用CD63、CD9、內容物syntenin-1的熒光抗體進行熒光標記。結果顯示的EVAAV6 組和對照組中的外泌體在被四跨膜蛋白CD81、CD63、CD9 抗體捕獲后表現(xiàn)出相似的syntenin-1表達水平。另外，四跨膜蛋白的 CD63、CD9 的熒光表達水平在兩組中也呈現(xiàn)接近的趨勢。總之，外泌體是 EVAAV6 組和對照組的主要組分。

圖 4  ExoView 檢測 EVAAV6 組和對照組的外泌體的表型和數(shù)量

　　在上述 3 篇文章中，科學家借助美國NanoView Biosciences 公司研發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView，直接檢測樣本中的外泌體，無需純化，操作簡單。一次結果直接輸出外泌體粒徑，絕對數(shù)目，蛋白表型，不同亞群的含量、多色熒光成像圖。3 篇文章分別從外泌體的表面電荷、內源性釋放的腫瘤源性外泌體、腺相關病毒載體等研究領域介紹了 ExoView 的無需純化，全面表征的特點，有力地證明 ExoView 是外泌體檢測的一大利器。

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　　■ 上海大學在《Journal of extracellular vesicles 》發(fā)表文章

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　　■ 北京天壇醫(yī)院、國家納米科學中心、北京航空航天大學在《Advanced Science 》發(fā)表文章

　　■ 同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院、上海思路迪轉化醫(yī)學團隊在《Journal of Nanobiotechnology 》發(fā)表文章

　　■ 山東千佛山醫(yī)院在《NANO LETTERS 》發(fā)表文章

　　■ 陜西師范大學在《Food & Function 》發(fā)表文章

　　■ 南京大學在《Frontiers in Cell and Developmental Biology 》發(fā)表文章

　　參考文獻：

　　[1] Sara Hassanpour Tamrin ...& Arindom Sen. (2023) Critical considerations   in determining the surface charge of small extracellular vesicles.

　　Journal of Extracellular Vesicles, 12:12353.

　　[2] Laurence Blavier ...& Yves A. DeClerck. (2023) The capture of   extracellular vesicles endogenously released by xenotransplanted tumours   induces an inflammatory reaction in the premetastatic niche.

　　Journal of   Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12326.

　　[3] Gijung Kwak ...& Jung Soo Suk. (2023) Extracellular vesicles enhance   pulmonary transduction of stably associated adeno-associated virus following intratracheal administration.

　　Journal of Extracellular Vesicles, 12:12324.

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