蛋白提取
蛋白樣品提取是蛋白定量和分析的基礎(chǔ)。天然蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)性能各異，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞裂解液制備蛋白樣品至關(guān)重要。選擇細(xì)胞裂解液時(shí)，除了要考慮蛋白產(chǎn)量，還要考慮所選擇的一抗的是否能識(shí)別線性的抗原表位。一些含有十二烷基硫酸鈉(SDS)和強(qiáng)離子去污劑(如脫氧膽酸鈉等)的蛋白質(zhì)裂解液能夠從組織或細(xì)胞中提取出大量的蛋白質(zhì)，適用于PAGE，Western blot等檢測(cè);但由于這類裂解液易使蛋白變性，因而不適于免疫共沉淀(Co-IP)等實(shí)驗(yàn)。當(dāng)使用某些只能識(shí)別非變性的抗原表位的抗體時(shí)，應(yīng)該選擇不含去垢劑或含有較溫和的非離子去污劑(如NP-40，Triton X-100等)的裂解液，而不能使用含有SDS和強(qiáng)離子去垢劑的蛋白質(zhì)裂解液。
蛋白濃度測(cè)定
確定蛋白樣品濃度對(duì)許多實(shí)驗(yàn)都是至關(guān)重要的。通常大多數(shù)蛋白樣品的濃度可以通過(guò)比色測(cè)定法定量。根據(jù)一些特殊化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)生顏色變化的原理，使用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測(cè)特定波長(zhǎng)下的吸光值，通過(guò)與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，可以換算出樣品中的蛋白含量。Bradford蛋白質(zhì)定量試劑(Cat. No. E161-01)具有靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、價(jià)格低廉的特點(diǎn);BCA蛋白質(zhì)定量試劑(Cat. No. E162-01)可提供更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，而且不受去垢劑的影響，更適宜微量蛋白的測(cè)定。
蛋白質(zhì)電泳和Western blot
蛋白質(zhì)電泳是分離、鑒定蛋白質(zhì)分子量和濃度的重要方法，尤其是聚丙烯酰胺凝膠電泳(Po l yac r y lamide Ge l Electrophoresis，PAGE)。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺可聚合形成具有分子篩效應(yīng)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)聚合物，作為電泳時(shí)的固相支持物。進(jìn)行非變性PAGE(Native PAGE)時(shí)，蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中保持完整的狀態(tài)，并依三種因素分開：分子量大小、形狀和所帶電荷。變性PAGE(SDS-PAGE)中，添加了作為變性劑和助溶劑的陰離子去垢劑SDS。SDS一方面可以打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，消除蛋白質(zhì)間形狀上的差異;另一方面可以和解聚后的氨基酸側(cè)鏈按比例結(jié)合，使得蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)蛋白質(zhì)本身的電荷量，消除了蛋白質(zhì)間的電荷差異。因此，在SDS-PAGE中，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)下的遷移速率只和其分子量大小相關(guān)。
不同濃度Tris-Glycine凝膠的最佳線性分離范圍
免疫印跡法(Western blot)是鑒定蛋白質(zhì)和多肽，以及檢測(cè)蛋白表達(dá)水平常用的手段。該技術(shù)通常是將經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)或多肽分子轉(zhuǎn)移到固相載體(PVDF膜或硝酸纖維素膜)上，通過(guò)目標(biāo)蛋白的特異性抗體(一抗)進(jìn)行免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的第二抗體(二抗)反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或發(fā)光，從而檢測(cè)到特異性目的蛋白。
