科研進(jìn)展

　　Moorfield薄膜生長設(shè)備的用戶英國劍橋大學(xué)Christopher J. Russo教授研究組利用高質(zhì)量的薄膜生長與加工技術(shù)制備了用于冷凍電鏡樣品制備的“HexAuFoil”金屬網(wǎng)，該金屬網(wǎng)使得冷凍電鏡觀察生物大分子樣品時樣品的位置漂移小于1埃米，進(jìn)一步提高了冷凍電鏡的成像質(zhì)量，該結(jié)果刊登在2020年10月的Science雜志上。“HexAuFoil”金屬網(wǎng)制備過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是采用Moorfield提供的高精度電子束蒸發(fā)技術(shù)以及液氮冷卻的低溫樣品臺，使得Au膜當(dāng)中的粒徑更小，在大縮小金屬網(wǎng)圓孔直徑的情況下仍保證了金屬網(wǎng)孔的圓度和質(zhì)量。

圖1：生長在Si 片上的“HexAuFoil”金屬網(wǎng)陣列

（圖片由分子生物學(xué)MRC實驗室的Neil Grant提供）

　　說到冷凍電鏡，近幾年在分子生物學(xué)方向可謂是大放異彩，我國生物學(xué)家利用冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面也做出了許多舉世矚目的重要成果。冷凍電鏡技術(shù)幾乎的實現(xiàn)了對生物大分子的高精度觀察。但在實際應(yīng)用中仍有很多因素限制了冷凍電鏡觀測精度的進(jìn)一步提升。其中重要因素之一是由于電子束照射導(dǎo)致金屬網(wǎng)上的玻璃態(tài)的水膜發(fā)生移動從而影響觀測精度。英國劍橋大學(xué)的Christopher J. Russo研究組對金屬網(wǎng)上玻璃態(tài)水膜的移動建立了物理模型，通過分析得出水膜的直徑和厚度存在一個臨界比值，超過臨界比值，水膜在快速冷凍過程中會由于應(yīng)力作用發(fā)生彎曲，并有部分應(yīng)力凍結(jié)在內(nèi)部。而在電子束照射時，由于電子束照射作用提高了水膜中水分子的擴(kuò)散系數(shù)（~1046倍），玻璃態(tài)的水膜便成為了一個“超粘流體”，水膜的應(yīng)力會進(jìn)一步的釋放使得水膜的曲率發(fā)生變化，從而導(dǎo)致了生物大分子的位移，而這個位移只發(fā)生在電子束照射時，從而影響成像質(zhì)量。

圖2：A冷凍電鏡在觀測時樣品的位置移動，B、C不同角度，不同孔徑對位移的影響，D水膜曲率變化導(dǎo)致樣品位移的示意圖。E孔徑比的臨界值（孔的直徑/水膜厚度）

　　如果縮小金屬網(wǎng)孔的直徑，使水膜的直徑和厚度比值在臨界以內(nèi)，在冷凍時水膜內(nèi)聚集的能量不足以使水膜發(fā)生彎曲，電子束照射的能量也不會引發(fā)水膜曲率的變化，僅僅會引起水分子的擴(kuò)散，而擴(kuò)散對成像的影響遠(yuǎn)小于曲率的變化。從而可以提高冷凍電鏡的成像質(zhì)量。因此制備高精度小孔徑金屬網(wǎng)格就顯得尤為重要。Christopher J. Russo課題組利用了高精的光刻和電子束蒸發(fā)薄膜制備技術(shù)在硅片上成功的批量制備出了孔徑在200 nm尺度的金屬支撐網(wǎng)，使得冷凍電鏡測量時樣品的位移小于1埃米。

圖3：利用“HexAuFoil”金屬網(wǎng)的冷凍電鏡觀測結(jié)果

　　后作者利用制備的“HexAuFoil”金屬網(wǎng)對223-kDa DPS蛋白質(zhì)進(jìn)行了冷凍電鏡的觀測。結(jié)果表明，采用“HexAuFoil” 金屬網(wǎng)可以有效減小樣品的移動，使得分辨率輕松突破2埃米（更多細(xì)節(jié)請參考原文）。該篇文章介紹了一種減小樣品位置漂移提高冷凍電鏡精度的有效途徑。

　　Moorfield薄膜制備與加工設(shè)備

　　Moorfield Nanotechnology是英國材料科學(xué)領(lǐng)域高性能儀器研發(fā)公司，成立26年來專注于高質(zhì)量的薄膜生長與加工技術(shù)，擁有雄厚的技術(shù)實力，推出的多種高性能設(shè)備受到科研與工業(yè)領(lǐng)域的廣泛好評。Moorfield公司近十年來與曼徹斯特大學(xué)諾獎技術(shù)團(tuán)隊緊密合作，推出的臺式高精度薄膜制備與加工系列產(chǎn)品由于其體積小巧、性能、易于操作更是受到很多科研單位的贊譽。Moorfield Nanotechnology推出的大型系列設(shè)備具有更大的配置自由度，可以滿足各種用戶的特殊功能需求，并且接受設(shè)備的特殊定制化設(shè)計。

　　冷凍電鏡背景介紹

　　2017年諾貝爾化學(xué)獎頒給了發(fā)明冷凍電鏡（Cryo-EM）的三位科學(xué)家，哥倫比亞大學(xué)教授Joachim Frank、蘇格蘭分子生物學(xué)家和生物物理學(xué)家Richard Henderson、以及瑞士洛桑大學(xué)生物物理學(xué)榮譽教授Jacques Dubochet以表彰他們在冷凍顯微術(shù)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)。嚴(yán)格來說，其實這次化學(xué)獎是頒發(fā)給了三維“物理學(xué)家”以表彰他們對生物領(lǐng)域做出的貢獻(xiàn)。Richard Henderson在20世紀(jì)90年代改進(jìn)了電子顯微鏡，實現(xiàn)了原子分辨率；Joachim Frank在70、80年代開發(fā)了一種圖像合成算法，能將電子顯微鏡模糊的二維圖像解析合成清晰的三維圖像；Jacques Dubochet發(fā)明了迅速將液體水冷凍成玻璃態(tài)以使生物分子保持自然形態(tài)的技術(shù)。這些發(fā)明使低溫冷凍電子顯微鏡得到很大的優(yōu)化。

　　為什么觀察蛋白質(zhì)等生物大分子需要冷凍電鏡呢？這是由于蛋白質(zhì)等生物大分子往往只能保存在水溶液中無法滿足電鏡的真空要求，并且這些生物大分子是通過氫鍵鏈接的，電子的轟擊會導(dǎo)致氫鍵斷裂破壞分子結(jié)構(gòu)，此外蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)是運動的，不是一個靜止?fàn)顟B(tài)。由于以上原因，普通電鏡是不能用于觀察蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)的?？茖W(xué)家們經(jīng)過探索發(fā)現(xiàn)，快速冷凍可使水在低溫狀態(tài)下呈玻璃態(tài)，減少冰晶的產(chǎn)生（水凝結(jié)成冰晶體積會膨脹從而會破壞生物分子結(jié)構(gòu)），從而不影響樣品本身結(jié)構(gòu)，生物大分子就可以冷凍在這個玻璃態(tài)的水里，通過冷凍傳輸系統(tǒng)保證在樣品始終保持在低溫狀態(tài)下，這樣就可以對樣品進(jìn)行電鏡觀察了。然后利用計算軟件通過大量的二維照片解析出生物大分子的三維結(jié)構(gòu)，這便實現(xiàn)了對生物大分子的高精度觀測。

　　近些年來，冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域大放異彩，使得對蛋白質(zhì)等生物大分子的研究取得了長足的發(fā)展。我國生物學(xué)家去年在新冠病毒研究方面取得的諸多進(jìn)展中也有很多重要的工作都用到了冷凍電鏡技術(shù)。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1]. Naydenova K , Jia P , Russo C J . Cryo-EM with sub–1 specimen movement[J]. Science, 370.

　　【相關(guān)產(chǎn)品】

　　1、臺式高精度薄膜制備與加工系統(tǒng)http://www.buyu5683.com/product/2021022371.shtml2.臺式高性能多功能PVD薄膜制備系列—nanoPVDhttp://www.buyu5683.com/product/2020061623.shtml3.多功能高磁控濺射噴金儀—nanoEMhttp://www.buyu5683.com/product/2020062924.shtml4.臺式氣氛\壓力控制高溫退火系統(tǒng)—ANNEALhttp://www.buyu5683.com/product/2020062923.shtml5.臺式超二維材料等離子軟刻蝕系統(tǒng)—nanoETCHhttp://www.buyu5683.com/product/2020061629.shtml6.臺式高性能CVD石墨烯/碳納米管快速制備系列—nanoCVDhttp://www.buyu5683.com/product/2020061627.shtml