小兒眼病的病情準確診斷與監(jiān)測一直是臨床上的一大難題，往往需要通過臨床癥狀來評判。因此，小兒眼病的診斷評估急需新的分子診斷技術(shù)的幫助。房水是眼球眼房中，介于角膜和晶狀體之間的無色透明水樣液體，主要作用為屈光、為眼內(nèi)組織提供營養(yǎng)和氧氣、排出其代謝產(chǎn)物和維持眼內(nèi)壓。使用前房穿刺術(shù)可以安全地取出房水，作為液體活檢樣本用于診斷和監(jiān)測眼病。
研究表明，外泌體在視覺系統(tǒng)中可能有重要作用，如外泌體與青光眼和黃斑變性的病理生理相關(guān)。由于血-視網(wǎng)膜屏障存在，房水中的外泌體主要由眼內(nèi)組織分泌，使得外泌體在眼病研究中更具有針對性。先前的研究中并未涉及房水外泌體的來源與分布，且由于技術(shù)手段的限制，至今尚未將房水外泌體與小兒眼病聯(lián)系起來。
基于以上研究成果與客觀需要，研究組獲取了患有不同眼病，包含先天性白內(nèi)障（CAT），先天性青光眼（GLC），小兒視網(wǎng)膜疾?。≒RD）和視網(wǎng)膜母細胞瘤（Rb）的19個不同患者的房水樣本，再將Rb患者根據(jù)治療情況分為經(jīng)過初步治療（診斷+初步切除）（Rb_Tn）和經(jīng)過主動治療（二次切除+化療）（Rb_Tx）兩組，使用全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng) ExoView的配套芯片，通過抗原抗體結(jié)合捕獲了房水中的特異性外泌體，無需純化，直接檢測了房水中存在的不同亞群的外泌體的含量。
在非腫瘤眼?。–AT+GLC+PRD）和Rb_Tx組中，CD63+外泌體數(shù)量顯著高于其他表型，表明房水CD63+外泌體占大多數(shù)（圖1c）。Rb_Tn組的外泌體數(shù)量要高于Rb_Tx，說明在化療前房水中可能含有大量腫瘤分泌的外泌體（圖1d）。
圖1 ExoView檢測不同患者樣本的外泌體跨膜蛋白的表達。
（a）不同眼病樣本的外泌體熒光圖像（紅色：CD63；綠色CD81；藍色：CD9）；（b）不同患者樣本經(jīng)過IgG陰性對照標準化的熒光顆粒計數(shù)表；（c）（d）不同組別樣本經(jīng)過IgG陰性對照標準化的熒光顆粒計數(shù)的柱形圖。
對不同組別的各個外泌體亞群進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，非腫瘤眼?。–AT+GLC+PRD）和Rb_Tx組中，僅表達CD63的外泌體數(shù)量多，Rb_Tn組的亞群則更加多樣化（圖2b&圖2c）； CAT/GLC/PRD/Rb_Tx組中CD63+外泌體在CD63捕獲位點中比例高（圖2d&圖2e），而在Rb_Tn組的比例則顯著小于其他組，但CD9+/CD63+，CD63+/CD81+和CD9+/CD63+/CD81+則相對更多（圖2f）。以上結(jié)果說明，僅表達CD63的外泌體是房水中所特有的，Rb_Tn組的其他亞群則與腫瘤相關(guān)，腫瘤的治療改變了外泌體的亞群組成比例。
圖2 ExoView檢測不同組別樣本的外泌體跨膜蛋白的共定位
（a）熒光圖像示例（紅色：CD63；綠色CD81；藍色：CD9）；（b）（c）不同組別的各個外泌體亞群數(shù)量；（d）（e）（f）不同組別的各個外泌體亞群比例。
為確認ExoView芯片捕獲的是膜結(jié)構(gòu)完整的外泌體，研究人員將兩份樣本經(jīng)Triton-X 100處理破壞外泌體膜結(jié)構(gòu)后，再使用ExoView檢測。與未經(jīng)處理的樣本對比，熒光顆粒計數(shù)有顯著下降，證明實驗檢測到的外泌體是脂雙層結(jié)構(gòu)完整的外泌體（圖3）。
圖3 Triton-X100處理過的房水樣品的跨膜蛋白表達。
在人的其他體液，如血漿和淋巴液中，CD63+外泌體占比僅為≤10%，而房水中CD63+外泌體的含量很高，說明CD63+外泌體可能是房水特有的。有研究表明，鼠視網(wǎng)膜色素上皮分泌的CD63+外泌體參與了巨噬細胞的細胞間通信。因此，CD63+外泌體可能與眼部的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。Rb患者房水中表型更加多樣化的外泌體來源可能是腫瘤細胞；經(jīng)治療后，CD63+外泌體比例上升，說明眼部趨向正常，因此，CD63+外泌體，以及腫瘤相關(guān)外泌體亞群的含量有作為腫瘤病情監(jiān)測指標的潛力。在今后的研究中，使用ExoView檢測含有更多種蛋白標志物和內(nèi)容物的外泌體，可以檢測并識別更多疾病相關(guān)的蛋白標志物和內(nèi)容物，助力小兒眼病的診斷和治療。
本研究中，科學(xué)家借助美國NanoView Biosciences公司研發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView，直接檢測病人樣本中微量的外泌體，無需純化，操作簡單。一次結(jié)果直接輸出外泌體粒徑，絕對數(shù)目，蛋白表型，不同亞群的含量。多角度全方位的佐證了外泌體或可作為液體活檢樣本用于診斷和監(jiān)測眼病。也說明了ExoView的無需純化，全面表征的特點是臨床液體活檢，尤其是微量檢測的一大利器。
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【參考文獻】
[1] Peng, C. C., Im, D., Sirivolu, S., Reiser, B., Nagiel, A., Neviani, P., ... & Berry, J. L. (2022). Single vesicle analysis of aqueous humor in pediatric ocular diseases reveals eye specific CD63‐dominant subpopulations. Journal of Extracellular Biology, 1(4), e36.
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