PART 1 CCK-8 簡介
■ CCK-8 比色檢測試劑盒
Cell Counting Kit-8，是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒。
CCK-8 溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中，不需要預(yù)配各種成分。WST-8 在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶的電子傳遞還原生成橙黃色的甲瓚(Formazan)。而線粒體脫氫酶只在活細(xì)胞中存在，因此細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；化合物的細(xì)胞毒性越大，細(xì)胞死亡量越多，則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺(生成的甲瓚量) 和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系?？赏ㄟ^酶標(biāo)儀檢測 430-490 nm 處的吸光度 (OD 值)，OD 值與細(xì)胞活力成正比，從而進(jìn)行定量分析。
圖 1. CCK-8 檢測原理
圖 2. 不同的細(xì)胞活力檢測方法的優(yōu)缺點
MCE CCK-8 產(chǎn)品一經(jīng)推出，就受到了大家的信賴和一致好評，其助力發(fā)表的文章數(shù)量也在逐年增加。小 M 對發(fā)表文章的影響因子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CCK-8 助力發(fā)文期刊的影響因子分布較廣，IF≥10 的共有 170+ 篇，5≤IF≤10 的共有 560+ 篇。
圖 3. 左：MCE CCK-8 助力發(fā)表文章數(shù)年增長情況
右：不同影響因子文章數(shù)分布情況
(截止至 2022 年 9 月)
■ 高分文獻(xiàn)驗證
其中最高分文章為中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所肖意傳教授團(tuán)隊的 Cytoplasmic DNA sensing by KU complex in aged CD4+ T cell potentiates T cell activation and aging-related autoimmune inflammation，發(fā)表在 Immunity (IF 43.474)。
其他高分期刊還包括
Mol Cancer (IF 41.444)；
Signal Transduct Target Ther (IF 38.104) ;
Adv Mater (IF 32.086) 等。
更多文章可下滑點擊
Cell Mol Immunol. 2022 Sep;19(9):1030-1041.
J Med Virol. 2022 Aug;94(8):3847-3856.
ACS Nano. 2022 Aug 3. 10.1021/acsnano.2c06300. Nat Commun. 2022 May 10;13(1):2563.
Immunity. 2021 Apr 13;54(4):632-647.e9. Adv Mater. 2021 Nov;33(45):e2104594. Nat Cell Biol. 2020 Dec;22(12):1447-1459. Signal Transduct Target Ther. 2020 Nov 6;5(1):216. Mol Cancer. 2019 Nov 14;18(1):161.
PART 2 CCK-8 的應(yīng)用與案例
■ 客戶驗證 1---細(xì)胞毒性實驗
為了驗證篩選的 iZAK2 對衰老相關(guān)自身免疫的治療作用，在小鼠原代 CD4+T 細(xì)胞中檢測了 iZAK2 的生物學(xué)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn) iZAK2 處理不影響細(xì)胞活力或細(xì)胞質(zhì) DNA 積累。此外，iZAK2 可減輕老齡小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎 (EAE) 相關(guān)自身免疫癥狀，以上結(jié)果都表明 iZAK2 是一種潛在的治療衰老相關(guān)自身免疫性疾病的化合物。
圖 4. iZAK2 對小鼠原代 CD4+T 細(xì)胞活力的影響[1]
■ 客戶驗證 2---細(xì)胞活力檢測
為了驗證 poly (I:C) 預(yù)處理在體外抑制炎癥反應(yīng)和凋亡細(xì)胞死亡，用 CCK-8 法檢測 H9C2 細(xì)胞中不同復(fù)氧時間和不同 poly (I:C) 濃度下的細(xì)胞活力，結(jié)果表明 poly (I:C) 預(yù)處理顯著抑制了糖氧剝奪 (OGD) 誘導(dǎo)的炎癥和凋亡反應(yīng)來限制細(xì)胞死亡。
圖 5. CCK-8 法測定不同復(fù)氧時間和
不同 poly (I:C) 濃度下的細(xì)胞活力[2]
■ 客戶驗證 3---細(xì)胞增殖測定
吞噬死亡細(xì)胞對于維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和預(yù)防炎癥是必不可少的，經(jīng)典理論認(rèn)為這一過程主要是由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等專職性吞噬細(xì)胞完成的。然而，越來越多的數(shù)據(jù)表明鄰近的非專職性細(xì)胞在這一過程中也發(fā)揮了作用。雖然吞噬的死細(xì)胞可以為活細(xì)胞提供營養(yǎng)，但實驗結(jié)果表明吞噬和沒有吞噬死細(xì)胞的細(xì)胞在增殖方面并沒有很顯著的差異。
圖 6. CCK-8 法測定 NIH 3T3 細(xì)胞
吞噬死細(xì)胞前后的細(xì)胞活力[3]
PART 3 CCK-8 使用注意小貼士
小白: CCK-8 與細(xì)胞孵育后一般多久可以檢測呢？
小M: CCK-8 的培養(yǎng)時間一般為 1-4 h，但在培養(yǎng) 30 min 左右即可肉眼觀察顯色程度，最佳反應(yīng)時間以具體顯色的最佳時間為準(zhǔn)。
小白: CCK-8 檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑會干擾檢測，那我該如何確定我的待測溶液是否有還原性呢？
小M: 將不含細(xì)胞的待測溶液孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，孵育 1-4 h 后，測定在 450 nm 處的空白吸光度。若測得的吸光度很小，則說明含有較少的還原劑，正式實驗可以直接加入 CCK-8 進(jìn)行檢測；若測得的吸光度相對較大，則說明存在較多還原劑，正式實驗時需去除培養(yǎng)基，將細(xì)胞洗滌兩次后，再加入新的培養(yǎng)基和 10 μL CCK-8 溶液。
小白: 那培養(yǎng)基中含有酚紅會對最終的實驗結(jié)果有影響嗎？
小M: 培養(yǎng)基中的酚紅不會影響實驗結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
小白:CCK-8 和活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶液顏色不斷加深，我該如何終止 CCK-8 反應(yīng)呢？
小M: 以下方法任選其一均可終止 CCK-8 反應(yīng)：a). 在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置 4℃ 冰箱內(nèi)；b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl 溶液；c). 每孔加 10 μL 1% (w) 的 SDS 溶液。
小M: 此外，需要注意！若培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問題?？梢栽?96 孔板的四周每孔中加入培養(yǎng)基或無菌 PBS，同時將培養(yǎng)板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，緩減蒸發(fā)。
小白：Get Get 新技能GET
參考文獻(xiàn)
1. Wang Y, et al. Cytoplasmic DNA sensing by KU complex in aged CD4+ T cell potentiates T cell activation and aging-related autoimmune inflammation. Immunity. 2021 Apr 13;54(4):632-647.e9.
2. Chen E, et al. Poly(I:C) preconditioning protects the heart against myocardial ischemia/reperfusion injury through TLR3/PI3K/Akt-dependent pathway. Signal Transduct Target Ther. 2020 Nov 6;5(1):216.
3. Lu J, et al. Efficient engulfment of necroptotic and pyroptotic cells by nonprofessional and professional phagocytes. Cell Discov. 2019 Aug 6;5:39.
